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开花是植物生命活动过程中的重要阶段,探寻植物开花的机理有助于缩短童期,加速植物育种进程。在生物体内,基因的表达和调控是生物体代谢、发育、生殖等一系列生理活动的根本所在。基因的特异性表达决定了生物体的特异性,启动子是直接调控基因特异性表达的重要元件,它决定了基因表达的强度、时间和空间等特异性。柑橘LEAFY(LFY)同源基因是促进植物成花的基因,TERMIANL FLOWER1(TFL1)同源基因是抑制植物成花因子。研究它们的表达调控机理对阐明基因功能,探索木本植物成花机制具有极大的意义。本研究以柑橘早花突变体早实枳(Precocious Trifoliate Orange)为试验材料,研究了两个关键基因PtTFL和PtLFY在早实枳成花转变过程中的表达特点及他们的表达调控特征,获得的主要结论如下:
1.实时定量PCR分析了在早实枳成花转变期PtLFY基因的表达,结果表明,PtLFY基因的表达随着植株生长发育而变化,在夏秋季表达低,12月份表达开始上升,1月份表达最强,并维持至3月份,之后mRNA表达随即下降。早实枳在4月份进行花芽分化,这个变化趋势说明PtLFY基因与早实枳的成花转变密切相关。
2.从早实枳和普通枳基因组中分离到PtLFY启动子2185 bp,两者同源性高达99％。在线分析软件表明该启动子转录起始位点A(+1),TATA box和CAAT box位于-30 bp和-63 bp,含有6个赤霉素感应元件,2个脱落酸感应元件,5个光感应元件和3个日照节律元件。此外,PtLFY启动子还含有两个甲基化岛,暗示表观调控可能也参与了PtLFY基因表达。
3.将PtLFY:GFP载体(De10)基因枪轰击洋葱表皮细胞,结果表明,在洋葱表皮细胞核和细胞膜中均有绿色荧光,能驱动GFP表达。PtLFY全长启动子(Del1)转入拟南芥的稳定研究结果显示,该启动子在拟南芥童期和成年期均有活性,且GUS表达主要集中在植物的顶端生长点,其活性随童期年龄的增加而增加,同时GUS在成年态植株早期花器官和果实中也有强烈表达。
4.构建5个PtLFY5’缺失启动子体,命名为Del2～Del6。除Del6外的缺失启动子都能启动子GUS表达,推测该启动子的关键元件位于-634～+1 bp。Del2～Del5缺失体均具有顶端分生组织专一性表达特点,也各有特异性。果荚中的表达仅在Del1和Del2出现；花发育的早期,仅Del1启动子可在花瓣表达；在根中的表达也仅在Del1中出现。各缺失启动子活性大小不一,比较植株25 d时5个启动子(Del6除外)活性,Del2活性为Del10.9倍,Del3活性为Del10.67倍,Del4与Del1活性相当,Del5活性最高,为Del11.2倍。
5.转基因拟南芥用激素及光照处理后,比较Del1启动子在植株生命活动中的最大启动子活性,赤霉素处理下Del1增加至1.02倍,脱落酸增加至1.2倍,短日照降低至0.6倍,短日照下赤霉素处理活性为0.8倍。赤霉素处理条件下,与长日照未处理植株比较Del2～Del5缺失启动子最大活性,Del2增加至1.2倍,Del3增加至1.7倍,Del4增加至1.3倍,Del5增加至1.2倍。将Del1,DeL2和Del5转基因拟南芥用脱落酸处理,在植株25 d时与对照比较活性,Del1的活力增加至1.2倍,Del2增加至2.1倍,Del5下降至0.56倍。
6.实时定量PCR分析了在早实枳成花转变期PtTFL基因的表达,结果表明PtTFL在早实枳童期表达较高。在成年态植株中成花转变到来前(1月份)表达量最高,转变期时表达量降至最低,在成年态营养器官,如根、茎、叶和花器官、果实中均有很高表达。这实验说明早实枳PtTFL基因维持植物营养生长并抑制植物成花。
7.分离了早实枳PtTFL启动子1287 bp,生物信息学分析发现,PtTFL启动子TATA box和CAAT box,位于-31bp和-290bp。PtTFL启动子含有2个赤霉素感应元件,2个光诱导元件和1个脱落酸类似元件。拟南芥转.PtTFL启动子表达发现,PtTFL启动子在童期的活性随着植株年龄的增长而增加,且表达部位集中在植物生长点附近,仅在成年态茎和叶中有表达,花器官不表达。赤霉素处理对PtTFL启动子的活性影响复杂,在成花转变前使启动子活性降低；脱落酸抑制了启动子的活性至0.75倍,短日照处理增加PtTFL启动子活性至对照1.3倍,短日照下喷施赤霉素使活性增至1.8倍。本实验说明,PtTFL启动子受到了赤霉素,脱落酸和日照长度的广泛调控。
本实验通过对促进植物成花的关键基因PtLFY和抑制成花基因PtTFL的启动子的研究,阐明了基因PtLFY和PtTFL的异位表达的特点及它们对外界条件的不同敏感性,为进一步阐明木本植物成花的分子机理奠定了基础。同时,研究得到的启动子资源可以有效地用于植物的转基因育种中,更有效、更有针对性地表达外源基因,解决转基因育种中的安全性问题,是转基因育种的有力工具。而利用研究得到的顺式作用位点,我们甚至在将来可以按人们的要求,制作特异的启动子,为人们的生产生活提供方便。