论文部分内容阅读
目的肝细胞癌是中国最普遍的恶性肿瘤之一,也是世界范围内发病率与致死率最高的恶性肿瘤之一。当前肝癌的临床治疗手段主要包括手术、化疗、放疗以及免疫治疗等,但是任何一种单一的治疗方式都存在各自的局限性。光疗法是近年来出现的一种非侵入性的医疗手段,包含光动力疗法（PDT）与光热疗法（PTT）。PDT/PTT协同化疗在癌症治疗中已显示出强大的潜力。肿瘤细胞中异常旺盛的代谢能力使得其拥有较高水平的活性氧。此外,一些治疗,如化疗和PDT将触发ROS产生,进一步提高在肿瘤细胞中的ROS水平。基于此,本论文合成了一种具有ROS响应性能的聚β-氨基酯(PBAEROS),对光敏剂IR780与化疗药物阿霉素（DOX）实现了高效共载,形成疏水内核,表面包裹具有抑制肿瘤新生血管活性的藻酸双酸酯钠（PSS）,构建纳米复合材料PSS/PBAEROS/IR780/DOX（PPID）纳米粒子,进行体外抗肿瘤作用的评价,并研究其初步的机制,为化疗和PDT/PTT协同治疗肝癌,以提供参考数据。内容本文的主要内容分为三个部分。第一部分为PPID纳米粒的制备与表征,主要包括PBAEROS的合成与结构确证,以及PPID纳米粒的制备与表征。第二部分为PPID纳米粒的体外研究,主要包括PPID纳米粒的ROS响应性能、光热和光动力效率的体外评价。第三部分为PPID纳米粒的体外药效学评价与体内靶向性初步探究,主要包括在肝癌Hep1-6细胞中考察PPID纳米粒的入胞、胞内定位及其联合PTT/PDT与化疗的协同抗肿瘤作用,以及在Hep1-6荷瘤小鼠体内考察PPID纳米粒的靶向性。方法1.PPID纳米治疗体系的制备与表征:合成了ROS敏感的双端羧基酮缩硫醇化合物（DCT）、双端羟基化酮缩硫醇（DET）及双端丙烯酸酯酮缩硫醇（DAT）,采用迈克尔加成反应合成了材料PBAEROS;利用凝胶渗透色谱法测定PBAEROS表观分子量;利用红外光谱（IR）和1H核磁共振光谱（1H-NMR）确定了DET、DCT、DAT和PBAEROS的化学结构;采用纳米沉淀法制备了PPID纳米粒;通过粒度Zeta电位分析仪检测了PPID纳米粒子的粒径及其分布和Zeta电位,评价纳米粒的尺寸和表面荷电性质;采用透射电镜（TEM）观察了PPID纳米粒的形貌;采用荧光分光光度计和紫外可见分光光度计检测PPID纳米粒中DOX和IR780的载药量（DC）和包封率（EE）。2.PPID纳米粒的体外性质研究:利用1H-NMR和透射电镜观察经H2O2处理后PPID纳米治疗体系的结构变化和形貌变化,考察PPID纳米治疗体系体外ROS响应性能;采用动态透析法检测PPID纳米粒中DOX的体外释药特征;利用红外热成像仪检测激光照射下PPID纳米溶液温度的变化,评价PPID纳米粒的体外光热效应;利用绿色荧光探针（SOSG）检测PPID纳米溶液中单线态氧自由基（1O2）的产生情况,评价PPID纳米粒的体外光动力效应。3.PPID纳米粒在细胞水平的药效学及体内靶向性初步探究:利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术考察小鼠肝癌Hep1-6细胞对PPID纳米粒的摄取情况;采用MTT法和活-死细胞染色考察PPID纳米粒对Hep1-6细胞的毒性及其PTT/PDT联合化疗的协同效应;利用细胞内荧光探针DCFH-DA和流式细胞术检测PPID纳米粒对Hep1-6细胞水平的影响;IR780利用本身的近红外荧光信号,并通过体内成像技术研究PPID纳米粒子在Hep1-6荷瘤小鼠的组织分布,评价纳米载体的肝癌靶向性。结果1.成功合成了PBAEROS,并对其进行了化学结构表征。制备了PPID纳米粒,电镜下呈现球状形貌,“核-壳”纳米结构清晰可见;粒径为189 nm,分散系数为0.162,放置过程中稳定性良好;Zeta电位为?43.3 m V;IR780的载药量为12.6%,包封率为89.6%;DOX的载药量为3.44%,包封率为97.5%。2.在808 nm近红外激光照射下,PPID纳米溶液的温度升高至60°C,表现出比游离IR780更强的光热效应;同时SOSG的荧光信号也显著强于游离IR780溶液,说明PPID纳米粒触发了ROS的大量生成,具有更高的光动力效应。在H2O2溶液中,PBAEROS分子结构中的酮缩硫醇能够高效率断键,造成PPID纳米粒解体并促进DOX更快地释放,120 h后DOX的累积释药量超过60%,证实PPID纳米粒具有显著的ROS响应性。3.PPID纳米粒的递送促进了疏水光敏剂IR780进入肝癌Hep1-6细胞,并且在808 nm近红外激光照射下表现出显著的PTT/PDT效应,通过升温和触发胞内ROS大量生成直接杀伤肿瘤细胞;同时利用酮缩硫醇的ROS响应性断键能力有效释放化疗药物DOX入核发挥细胞毒效应,进而表现出PDT/PTT与化疗的协同抗肿瘤作用。成功构建小鼠肝癌Hep1-6皮下移植瘤模型;尾静脉给药后,PPID纳米粒子主要分布在Hep1-6荷瘤小鼠的肿瘤组织,并且表现出某种程度肝细胞癌靶向性。结论通过在单体结构中引入酮缩硫醇化学键成功地合成了一种ROS响应的聚β-氨基酯PBAEROS,并对其进行了结构确证。以PBAEROS和PSS为载体材料,采用一步沉淀法制备了共载光敏剂IR780与化疗药物DOX的纳米治疗体系PPID纳米粒;该纳米粒呈现规则球状形貌,具有PBAEROS疏水内核和PSS亲水外壳,并表现出显著的体外光热和光动力效应,以及ROS响应性的体外释药性能。PPID纳米粒能够促进IR780进入肝癌Hep1-6细胞,并且在808 nm近红外激光照射下表现出显著的PTT/PDT效应,通过升温和触发胞内ROS大量生成直接杀伤肿瘤细胞;同时利用酮缩硫醇的ROS响应性断键能力有效释放化疗药物DOX入核发挥细胞毒效应,表现出PDT/PTT与化疗的协同抗肿瘤作用。综上,PPID纳米粒为联合光学疗法与化疗治疗肝癌提供了一种新的纳米载体系统。