TBC1D7、GRB10基因表达调控及其与关岭牛生长性状相关性研究

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关岭牛是贵州省优良地方肉牛品种资源。有研究表明其肌肉蛋白中氨基酸种类齐全,富含人体必需氨基酸和鲜味氨基酸、肉质细嫩、烹饪风味佳,是一种优质蛋白来源,深受消费者喜爱。但关岭牛生长速度较慢和产肉性能较差等问题,对其产业发展造成了一定程度的影响。雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路是参与机体代谢、蛋白质合成和细胞生长等生理功能的重要通路。TBC1蛋白家族第7成员(TBC1D7)和生长因子受体结合蛋白10(GRB10)分别是处于m TOR信号通路上下游的重要成员,已有众多研究表明它们与生长发育相关。本研究以贵州关岭牛为试验对象,以TBC1D7、GRB10基因为候选基因,以直接测序法检测TBC1D7、GRB10基因上的单核苷酸多态性(SNP)并进行生物信息学分析;对各突变位点进行分型,测定8项生长性状指标,分析两个基因的SNPs不同基因型与关岭牛生长性状的相关性;测定并分析了不同时期关岭牛9个不同组织中的基因m RNA水平表达量;通过构建TBC1D7和GRB10基因真核表达载体,转染关岭牛成肌细胞,检测生长发育主效基因的表达水平变化。通过探索TBC1D7、GRB10基因对牛生长发育的影响为关岭牛的科学选种选育提供理论参考。主要研究结果如下:1、在关岭牛TBC1D7基因上共检测到5个SNPs,分别为:5外显子上的g.12972T>C、g.12984A>G;6外显子上的g.20538C>T、g.20577T>C和8外显子上的g.24807G>A。GRB10基因中共筛查到5个SNPs。分别为11内含子上的g.193768C>G和g.194018G>A,12外显子上的g.194184G>A,15内含子上的g.207578G>A与g.207620G>C;生物信息学分析表明:g.12972T>C、g.12984A>G、g.20538C>T、g.20577T>C和g.194184G>A位点使m RNA二级结构自由能发生了变化;关岭牛TBC1D7、GRB10蛋白的相对分子质量分别为33904.44k Da和59857.50k Da、均表现为亲水性、不存在信号肽,皆存在潜在的N-糖基化位点,在空间结构上两个蛋白差异较大。2、两个基因的10个SNP位点均具有3种基因型,有效等位基因数较高,多态信息含量均为中度多态(0.25<PIC<0.5),χ2检验显示所有位点基因型分布均显著偏离Hardy-Weinberg平衡(p<0.05);TBC1D7基因g.24807G>A变异位点杂合型(GA)个体体斜长、胸围、后臀围显著大于突变型(AA)个体(P<0.05)。GRB10基因g.194018G>A位点杂合型(GA)个体体斜长、胸围、后臀围显著大于突变型(AA)个体(P<0.05);g.194184G>A变异位点杂合型(GA)个体胸围和后臀围显著大于野生型(GG)和突变型个体(AA)(P<0.05)。3、TBC1D7基因在关岭牛心、肝、肺、肾、大脑、脊髓、小肠、背最长肌和后腿肌9组织中均有表达。在肝脏和脊髓中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01),肺脏中的表达量次之,在大脑,肾脏和小肠中也有一定程度的表达,心脏、背最长肌和后腿肌中的表达量极显著低于其它组织(P<0.01);GRB10基因在关岭牛9个组织中均有表达。在肝脏中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01),肺脏中的表达量次之,在肾脏、小肠、心脏和脊髓中也有一定程度的表达。在背最长肌、后腿肌和大脑中的表达量极显著低于其它组织(P<0.01)。4、成功克隆了TBC1D7、GRB10基因CDS区,构建了pEGFP-N3-TBC1D7、pEGFP-N3-GRB10真核表达载体。在牛成肌细胞中过表达TBC1D7基因后,发现GRB10基因表达量显著增加,IGF1基因表达量显著减少,IGF2基因表达量小幅下降;过表达GRB10基因,发现TBC1D7基因表达量显著增加,IGF1、IGF2基因表达量变化不显著。
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