野桑蚕羧酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

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根据NCBI上的家蚕羧酸酯酶基因序列(GenBank登录号DQ443360)设计引物,提取野桑蚕中肠的RNA,采用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕羧酸酯酶基因(GenBank登录号:EF157830)。序列分析表明,该基因的ORF为1923 bp,编码641个氨基酸,预测其相对分子质量约为71.7 kD,等电点为4.82。野桑蚕羧酸酯酶核苷酸序列及推导的氨基酸序列经与家蚕同源比较发现两者有33个碱基、12个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸同源性分别达到98.3%和98.6%。经与桃蚜(Myzus persicae)、果蝇(Drosophila pseudoobscura)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)等进行同源性比较发现不同昆虫间酯酶的同源性较低,但是它们都具备在酯酶活性中心位置,二硫键形成位点处存在高度保守的氨基酸序列的特征,因此推测其可能与昆虫抗性相关。将野桑蚕羧酸酯酶基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21中,经1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析表明在约75.7 kD大小位置,出现了一条特异性蛋白质条带。然后通过Western Blot分析表明在预期的约75.7 kD大小位置出现较明显的条带,而对照BL21菌和空pET-28a(+)转化BL21菌都没有检测到条带,证明了野桑蚕羧酸酯酶基因得到表达。野桑蚕羧酸酯酶基因的成功表达为进一步通过构建其体外重组体系,研究对外源物质的代谢,最终确定其功能打下了基础。
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