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猪圆环病毒为（Porcine circovirus,PCV）圆环病毒科圆环病毒属成员,猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是猪圆环病毒性疾病（Porcine Circovirus Diseases,PCVD）的主要病原体,也是威胁世界养猪业的主要病原之一,给养猪业造成了巨大经济损失;猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）于2016年在美国首次报道,与猪的多种疾病相关,发展至今在世界范围内流行。本研究首先调查了PCV2和PCV3在吉林省的分子流行病学情况、遗传变异以及进化规律。然后分离鉴定流行毒株并研究其致病性,经上述调查及鉴定后,本试验围绕当前流行毒株展开PCV2和PCV3二联亚单位疫苗的研究,最终通过动物接种试验评价疫苗的免疫保护效果。为吉林省PCV2和PCV3的防控提供技术支持。本研究具体结果如下:1.PCV2和PCV3双重荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法的建立及应用根据Gen Bank公布的PCV2和PCV3序列,筛选保守序列并设计特异性引物和探针,分别建立PCV2和PCV3单重FQ-PCR检测方法,在此方法基础上,优化反应体系和反应条件,建立PCV2和PCV3双重FQ-PCR检测方法。结果表明,构建的双重FQ-PCR检测方法最低检测限为1×10~1 copies/μL,批间和批内重复变异系数均小于2%,且PCV2与PCV3间无交叉反应,表明该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性。应用该方法对2018～2019年间吉林省采集的137份组织样本进行检测,结果显示,PCV2、PCV3及两种病源混合感染的检出率分别为56.90%、25.5%和20.44%;而普通PCR的检出率分别为52.55%、23.36%和18.25%,表明该方法适用于临床样本检测。2.PCV2和PCV3分子流行病学调查及分离毒株致病性研究为明确PCV2和PCV3在吉林省内的流行情况,对2018年9月到2021年6月间采集自吉林省不同区域的13个猪场的1065份样品进行检测。PCV2和PCV3的单独感染率分别为51.83%和33.99%;二者的混合感染率为18.40%。选取16个PCV2阳性样品和13个PCV3阳性样品对其ORF2基因进行测序和遗传进化分析。结果显示,16个PCV2ORF2基因序列同源性为93.0%～99.7%,其中3个毒株为PCV2b基因型,其余13个毒株均为PCV2d基因型;13个PCV3 ORF2基因序列同源性为96.7%～99.5%,其中1个毒株为PCV3c基因型,其他12个毒株为PCV3b基因型。针对目前主要流行的PCV2和PCV3基因型,应用PK-15细胞分离PCV2,应用猪肾上皮原代细胞分离PCV3,分别获得PCV2 JL11株和PCV3 JL3株病毒,分别为PCV2d基因型和PCV3c基因型。2株分离病毒致病性研究结果表明,PCV2 JL11株攻毒后可引起猪日增重明显下降,产生明显的病毒血症,肺脏和腹股沟淋巴结产生明显病理变化;PCV3 JL3株攻毒后可引起猪日增重轻微下降,产生较明显的病毒血症。表明分离的PCV2 JL11株和PCV3 JL3株病毒对猪有致病性。3.重组Ac-PCV2-Cap、Ac-PCV3-Cap和Ac-PCV2/PCV3 Cap杆状病毒的构建以分离毒株PCV2 JL11和PCV3 JL3株的Cap蛋白氨基酸序列为参考,针对Sf9细胞进行密码子优化,以杆状病毒p Fastbac1为载体,构建获得单独表达PCV2 Cap蛋白和PCV3 Cap蛋白的重组杆状病毒Ac-PCV2-Cap和Ac-PCV3-Cap,以及共表达两种蛋白的重组杆状病毒Ac-PCV2/PCV3 Cap。Western Blot和IFA结果显示,PCV2-Cap和PCV3-Cap及PCV2/PCV3 Cap蛋白可在Sf9细胞中表达,表明Ac-PCV2-Cap、Ac-PCV3-Cap和Ac-PCV2/PCV3 Cap所表达的蛋白具有较好的反应原性。4.二联重组杆状病毒亚单位疫苗PCV2/PCV3 Cap对小鼠免疫原性的研究分别以ISA206和GEL02佐剂制备亚单位疫苗免疫小鼠,通过特异性抗体检测和淋巴细胞增殖检测,确定GEL02为亚单位疫苗佐剂。分别以不同浓度的PCV2-Cap蛋白和PCV3-Cap蛋白制备亚单位疫苗,通过抗体检测和淋巴细胞增殖检测,确定以30μg/m L作为疫苗中抗原浓度。按照优化的佐剂和抗原浓度分别制备PCV2-Cap亚单位疫苗、PCV3-Cap亚单位疫苗,PCV2-Cap+PCV3-Cap亚单位疫苗和PCV2/PCV3 Cap亚单位疫苗,并免疫小鼠。特异性抗体、中和抗体、淋巴细胞增殖、细胞因子结果表明,4种亚单位疫苗均可诱导小鼠较好的体液免疫及细胞免疫应答;免疫后攻毒试验结果表明,4种亚单位疫苗分别针对PCV2 JL11和PCV3 JL3毒株的攻击均能产生较好的保护作用,能够减少病毒血症,降低组织内的病毒载量及降低脏器的病理损伤。5二联重组杆状病毒亚单位疫苗PCV2/PCV3 Cap对猪免疫原性的研究将制备的亚单位疫苗PCV2-Cap、PCV3-Cap和PCV2/PCV3 Cap分别免疫28日龄仔猪。抗体检测结果表明,在首次免疫21天能够检测到特异性抗体和中和抗体,且在35天时抗体效价最高;猪外周血淋巴细胞增殖反应和淋巴细胞亚群含量检测结果表明,各亚单位疫苗均可诱导仔猪产生较高水平的细胞免疫应答;细胞因子检测结果表明,各亚单位疫苗均能诱导仔猪产生高水平的IFN-γ和IL-4,引起Th1和Th2型免疫应答。免疫后攻毒保护试验结果表明,PCV2 JL11和PCV3 JL3分别攻毒后,亚单位疫苗PCV2-Cap、PCV3-Cap和PCV2/PCV3 Cap组与PBS组相比,能够减少病毒血症,降低组织内的病毒载量,降低脏器的病理损伤,表明疫苗免疫能够抵抗PCV2和PCV3的攻击,为试验猪提供良好的保护效果。