【摘 要】
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目的:动脉钙化（Arterial calcification,AC）是多种疾病的共同病理过程,其调控是主动的,是异位钙化的一种,涉及到血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）向成骨样细胞表型的转分化。既往研究表明左旋肉碱（L-carnitine,LC）是一种抗氧化损伤的关键药物,可以保护细胞免受氧化损伤的影响,作为一种抗氧化剂,左旋肉碱是否能抑制β-甘
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目的:动脉钙化（Arterial calcification,AC）是多种疾病的共同病理过程,其调控是主动的,是异位钙化的一种,涉及到血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）向成骨样细胞表型的转分化。既往研究表明左旋肉碱（L-carnitine,LC）是一种抗氧化损伤的关键药物,可以保护细胞免受氧化损伤的影响,作为一种抗氧化剂,左旋肉碱是否能抑制β-甘油磷酸钠（beta-glycerophosphate,β-GP）对VSMCs的成骨样分化需要进一步研究。方法:（1）α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）是VSMCs的特征性蛋白,用免疫荧光法鉴定α-SMA,进而验证购买细胞为VSMCs。（2）采用10mmol/Lβ-GP诱导细胞成骨样分化,从而构建小鼠钙化细胞模型,将不同浓度（100、200、400、600、800μmol/L）的左旋肉碱作用于体外培养的小鼠VSMCs,通过CCK8法检测细胞的活力,选取适宜的低、中、高浓度（200、400、800μmol/L）的左旋肉碱作为后续实验处理浓度。（3）后续实验分为5组:对照（control）组,钙化（β-GP）组,低、中、高浓度左旋肉碱（LC+β-GP）组,通过茜素红染色验证钙化成功,并通过钙化结节面积评估细胞钙化程度。（4）活性氧试剂盒检测5组细胞,通过显微镜下平均荧光强度来验证活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平。（5）q PCR法分析Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor2,RUNX2）和骨形成蛋白-2（bone morphology protein-2,BMP-2）;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotin amide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOX4）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）m RNA的表达。结果:（1）通过免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）可见绿色荧光肌丝状排列于细胞质内,验证为α-SMA,进一步证明为VSMCs。（2）不同浓度（100、200、400、600、800μmol/L）的左旋肉碱和10mmol/Lβ-GP处理小鼠VSMCs 24h、48h、72h,对细胞活力无明显影响。（3）茜素红S染色结果显示:5组均可观察到矿化结节,钙化组结节最为明显。与钙化组相比,左旋肉碱所有药物处理组橘红色矿化结节显著性减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（4）ROS检测结果显示:与对照组相比,钙化组ROS生成显著性增强,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与钙化组相比,左旋肉碱药物处理组ROS生成均显著性减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（5）q PCR法结果显示:与对照组相比,钙化组所有指标m RNA表达量均显著性增强,差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着左旋肉碱药物处理浓度的升高,所测得四种指标m RNA的含量减少。与钙化组相比,中、高浓度左旋肉碱组中钙化指标:RUNX2和BMP-2;氧化指标:NOX4和CAT的m RNA表达量均显著性减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:左旋肉碱对小鼠VSMCs的成骨样分化有明显抑制作用,其机制可能与氧化应激途径有关。并且在一定范围内,随着左旋肉碱浓度的增加,小鼠VSMCs成骨样分化程度降低。
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