第一部分利用脂质插入修饰细胞外囊泡实现结肠癌的SPECT/NIRF成像背景:近年来,肿瘤细胞来源的细胞外囊泡（tumor cells derived-extracellular vesicles,TEV）作为药物递送的纳米载体已成为研究热点,有广阔的临床应用前景。以TEV为纳米载体构建多模态影像分子探针既可以实现肿瘤诊断,又能在活体内无创性示踪TEV,从而加速TEV的临床转化。目前基于TEV的多模态显像探针较少有文献报道。在本研究中,我们采用脂质插入的方法修饰TEV,构建了可以实现结肠癌单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和近红外荧光（NIRF）成像的分子探针,并通过多模态成像比较了TEV与脂肪干细胞来源细胞外囊泡（adipose stem cells derived-extracellular vesicles,AEV）的肿瘤靶向能力。方法:本研究采用经典的差速超速离心法从HCT116肿瘤细胞及人脂肪干细胞上清液中分离TEV和AEV,透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）和动态光散射（dynamic light scattering,DLS）观察细胞外囊泡的形态、粒径和电位。流式、细胞荧光实验和共聚焦成像评估细胞外囊泡与肿瘤细胞结合能力。随后在细胞外囊泡表面通过脂质插入的方法修饰近红外荧光染料花菁素（cyanine7,Cy7）和双功能螯合剂肼基烟酸（hydrazinonicotinic acid,HYNIC）,然后进行99mTc标记以获得99mTcTEV-Cy7和99mTc-AEV-Cy7。为了研究基于TEV的纳米探针的肿瘤靶向能力及其在结肠癌可视化中的应用,本课题组进行了一系列体内外实验,包括细胞摄取,SPECT和NIRF成像及离体生物分布等。脂肪干细胞来源的细胞外囊泡（99mTc-AEV-Cy7）被设定为非特异性对照,以证实99m Tc-TEV-Cy7具有较好的肿瘤靶向能力。本研究还通过体外CCK毒性实验和体内血生化、主要器官HE染色实验研究了该纳米探针的毒性。结果:本课题组成功从细胞上清中分离出了细胞外囊泡,TEM证实了细胞外囊泡具有膜结构。TEV的水合粒径和电位分别为110.87±4.61 nm和–9.20±0.41 m V。流式、细胞荧光和共聚焦实验证实了TEV具有较好的肿瘤结合能力。HCT116肿瘤细胞对99mTc-TEV-Cy7的摄取率随着时间增加,在共孵育24 h时达到峰值,随后逐渐下降。NIRF和SPECT成像显示最佳的成像时间点是在尾静脉注射99mTc-TEV-Cy7后18 h,此时肿瘤摄取（1.46%±0.06%ID/g）、肿瘤与肌肉的摄取比例（8.22±0.65）均达到峰值。与放射性标记的脂肪干细胞来源的细胞外囊泡（99m Tc-AEV-Cy7）相比,99m Tc-TEVCy7在荷瘤小鼠中呈现出更多的肿瘤蓄积。体外与体内实验均显示该纳米探针无明显毒性,生物安全性高。结论:本部分研究基于细胞外囊泡这种天然纳米载体成功构建了可以进行SPECT和NIRF成像的纳米探针。实验结果证实了细胞外囊泡稳定性良好、表面易修饰、与肿瘤细胞亲和性高且生物安全性高,是构建多模态显像探针的理想纳米载体。脂质插入的方法也被证实可以修饰细胞外囊泡,该方法成本低,操作简单且几乎不影响细胞外囊泡的生物学活性,在细胞外囊泡的生物学研究中具有广阔的应用前景。此外,通过多模态成像的方式证实了TEV比AEV具有更好的肿瘤靶向能力。第二部分预定位策略构建的细胞外囊泡纳米探针在原位结肠癌中的多模态成像及影像引导手术背景:在第一部分研究中,我们使用脂质插入法构建了基于细胞外囊泡的多模态分子探针,并最终成功地实现了荷瘤鼠的SPECT/NIRF多模态成像。在本研究中,我们针对SPECT显像时99mTc-TEV-Cy7在肝肾脾摄取过多以及肿瘤来源细胞外囊泡产率低的问题,利用预靶向策略构建基于脂肪干细胞来源细胞外囊泡的纳米探针,以正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）和近红外荧光（near-infrared fluorescence,NIRF）成像可视化结肠癌,并探索其在影像引导手术中的应用。方法:本研究采用经典的差速超速离心法从脂肪干细胞（adipose stem cells,ASCs）上清液中分离出细胞外囊泡,即AEV,并进行表征。随后分析该细胞外囊泡的体外毒性及其与肿瘤细胞的亲和力。本研究同时将1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[花菁素7（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000-Cy7）和带叠氮基团的DSPE-PEG2000（DSPEPEG2000-N3）修饰到AEV的表面（N3-EV-Cy7）,随后引入68Ga-L-NETA-DBCO进行体内点击化学反应,在不同时间对荷瘤裸鼠分别进行PET/CT和NIRF显像,以选择最合适的显像时间。本研究还构建了结肠原位移植瘤进一步证实该纳米探针可以示踪结肠癌。最后,在实时NIRF成像的引导下,进行结肠癌的手术切除。结果:透射电镜证实该囊泡具有含脂质双分子层的膜结构。DLS测定AEV的水合粒径为136.5±2.5nm,Zeta电位为-7.93±0.24 m V。体外细胞毒性试验显示,HCT116结肠癌细胞或脂肪干细胞与AEV以不同浓度和不同时间共同孵育,细胞存活率均大于90%。细胞荧光实验及共聚焦实验显示细胞外囊泡被肿瘤细胞摄取和内化。PET图像和生物分布数据表明,最佳预定位时间为注射放射性示踪剂前20 h,最佳成像时间为注射放射性示踪剂后2 h。NIRF成像显示尾静脉注射N3-EV-Cy7后在不同的时间点均可观察到肿瘤部位较高的荧光信号。最后,在实时NIRF成像的引导下,进行了手术切除肿瘤。结论:本实验基于细胞外囊泡成功构建了可以示踪结肠癌的PET/CT/NIRF多模态显像分子探针。基于点击化学的预定位策略被应用来匹配短半衰期核素68Ga和长生物半衰期的细胞外囊泡,与前期SPECT成像相比,减少了肝脾摄取,增加了靶标/非靶标比率,改善了核素成像质量。在结肠原位癌模型的多模态显像中,进一步证实该纳米探针有望实现对结肠癌进行术前评估（PET/CT成像）与实时图像引导手术（NIRF成像）的完美结合。总之,本研究通过体内外实验证明了该纳米探针具有广阔的临床应用前景,细胞外囊泡这种天然纳米载体在分子影像中也具有临床转化价值。