弯曲菌（Campylobacter）是目前受到国内外广泛重视的食源性病原菌,可导致人类感染弯曲菌病,引起腹痛、腹泻等病症,免疫力低下者感染可产生米勒-费舍尔综合征（MillerFisher Syndrome,MFS）和格林-巴利综合症（Guillain-Barre Syndrome,GBS）等相关并发症。弯曲菌污染食品来源较为广泛,其中饮用受污染的牛奶是弯曲菌病暴发的常见原因。因此,监测挤奶环节原料奶中弯曲菌流行情况极其重要。由于牛奶中的复杂成分对弯曲菌检出存在一定的影响,本研究通过优化牛奶中弯曲菌分离方法,并将其应用于奶牛养殖场挤奶环节,探究弯曲菌在牛奶生产过程中的流行规律及耐药水平,利用全基因组测序技术对弯曲菌分离株进行分子溯源分析,解析挤奶环节弯曲菌的传播规律,以期为奶牛的饲养管理和挤奶环节弯曲菌的防控提供借鉴。1.牛奶中弯曲菌分离方法的优化本研究首先通过单因素实验分析离心力与离心时间对牛奶中弯曲菌回收率的影响,并通过响应面分析法确定最佳离心参数进行验证,确定最佳离心力为8500×g,离心时间为15 min。基于最佳离心条件确定增菌培养基及增菌方式,即在MH增菌培养基中添加5%胎牛血清进行增菌培养24 h效果最佳。应用优化的方法和FDA方法对人工污染牛奶以及生鲜奶样品进行弯曲菌分离比较,结果表明本研究优化的方法对脱脂奶、低脂奶、全脂奶的检出率高于FDA方法,在生鲜奶样本检测中,本研究优化的方法检出率也高于FDA方法,表明本研究优化的方法可提高牛奶中弯曲菌分离检测效率,且具有适用范围广的优点,整体上优于FDA方法。2.养殖阶段牛奶生产中弯曲菌流行病学调查本研究从江苏省某规模化奶牛养殖场共采集样品1186份,包括生鲜奶样品180份、奶牛肛拭样品288份、新鲜粪便样品250份、环境样品468份,弯曲菌平均阳性率为4.72%。总计检测出56例弯曲菌阳性样品,空肠弯曲菌为该养殖场优势种属。对牛奶生产过程进行分析,发现挤奶后的弯曲菌平均阳性率（4.93%）高于挤奶前（2.25%）,挤奶前的弃奶是弯曲菌主要污染点（3.33%）,挤奶后的新鲜粪便（11.00%）和生鲜奶（3.33%）弯曲菌阳性率较高。弯曲菌分离株普遍耐存在环丙沙星、四环素、氨苄青霉素耐药表型,且多重耐药现象较为严重,多重耐药谱主要为2耐（45.76%）和3耐（42.37%）,耐药谱型分别为CIP-TET（环丙沙星-四环素）、AMP-CIP-TET（氨苄青霉素-环丙沙星-四环素）,耐药基因blaOXA-61、tet（O）主要集中于ST21、ST38、ST61、ST604,空肠弯曲菌的多重耐药现象比结肠弯曲菌更为严重。对弯曲菌分离株进行分子溯源分析,显示牛奶源弯曲菌分离株与粪便源弯曲菌分离株同属于一个进化分支,毒力基因检测显示分离株均携带iamA、ciaB、cdtB、cdtC、cheY、cadF6种毒力基因,且不同ST型菌株的毒力基因分布存在差异。