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1996年H5N1亚型高致病性禽流感病毒（Avian influenzavirus,AIV）首次在中国报道,后在禽类中逐渐传播,引起的发病率和致死率极高。目前,H5亚型AIV已在我国呈地方性流行并偶有跨种传播的发生,不仅对养禽业造成严重的经济损失,也对公共卫生安全造成潜在威胁。由于H5亚型AIV快速易变特性和疫苗免疫选择压的存在,毒株抗原变异和遗传进化加剧,能够区分自然感染和免疫动物（Differentiate Infected from Vaccinated Animals,DIVA）的疫苗在AIV的免疫监测和防控净化方面具有一定优势。实验室前期基于H5亚型AIVHA2特异性抗原表位H5-17th肽构建了标记疫苗候选株DTC-Lo-171和DTC-Lo-173,但没有评价其免疫效力,也未建立评估其DIVA特性的配套检测方法。本研究首先制备了针对H5-17th肽的单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）,其次建立了能够有效区分H5亚型野毒感染血清和标记疫苗免疫血清的竞争ELISA方法,最后对H5亚型标记疫苗候选株进行了免疫水平和保护效力评价,并应用上述建立的方法评价了该标记疫苗的DIVA特性,为H5亚型禽流感的免疫防控和种群净化奠定基础。1.H5亚型AIV HA2蛋白特异性抗原表位单克隆抗体制备将实验室前期已鉴定的H5亚型AIV HA2特异性抗原表位H5-17th肽与载体蛋白牛血清白蛋白（Albuminfrom Bovine Serum,BSA）偶联作为免疫抗原,成功制备了 3株具有ELISA和IFA特性的McAb 3E10、3G6和4F8,以及3株仅具有IFA特性的McAb 2C2、3C10 和 5G6。3E10 单抗腹水 ELISA 效价为 1:4.096×106,3G6 和 4F8 为1:2.048×106。亚类鉴定显示,3E10和4F8为IgG1亚类,3G6为IgM亚类。采用H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10亚型AIV和NDV进行了单抗特异性检测,结果表明2C2、3C10、3E10、3G6和4F8仅与H5亚型AIV发生反应,特异性良好,而5G6与各亚型AIV具有广谱反应性;采用H5亚型Clade 2.3.4、2.3.2.1d、2.3.2.1e、2.3.4.4b、2.3.4.4c、2.3.4.4h、2.3.4.4d和2.3.4.4e毒株进行了单抗广谱性检测,结果表明2C2、3C10、3E10、3G6、4F8和5G6均能与之反应,广谱性良好,为后续建立竞争ELISA方法奠定了基础。2.区分H5亚型AIV标记疫苗免疫血清和野毒感染血清竞争ELISA方法的建立以H5亚型AIV DTC株感染血清及疫苗候选株DTC-Lo-171和DTC-Lo-173免疫血清为测试血清样品,利用竞争ELISA方法测定了 3株McAb3E10、3G6和4F8的抑制率,选取具有较高抑制率的IgG1亚类的3E10（43.89%）作为竞争单抗建立检测方法,并对反应条件进行逐步优化。以H5-17th肽为包被抗原,通过方阵试验探索最佳反应条件,确定最适包被浓度为25 μg/mL,竞争单抗3E10最佳工作浓度为1:400,待检血清最佳稀释度为1:1,最佳封闭液条件为5%脱脂乳封闭60 min,底物最佳作用时间为10min。在此优化条件的基础上,确定待检样品的阴性临界值为15.82%,阳性临界值为20.03%,介于两者之间则需重新测定。运用本方法检测DTC感染血清以及H5亚型 Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8、Re-10、Re-11 和 Re-12 疫苗免疫血清均为阳性,标记疫苗 DTC-Lo-171 和 DTC-Lo-173 免疫血清以及 H1、H3、H4、H6、H7、H8、H9 和H10亚型阳性血清均为阴性,表明该竞争ELISA方法具有良好的特异性和广谱性。3.H5亚型AIV标记疫苗候选株的免疫效力及DIVA特性评价为评价H5亚型标记疫苗候选株的免疫水平,将DTC、DTC-Lo-171和DTC-Lo-173制备灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡,定期采血测定免疫血清HI抗体效价。结果显示,DTC-Lo-171 免疫 SPF 鸡群后 21 d HI 抗体效价（Log2）达 6.60±1.19,优于 DTC（6.40±1.05）和 DTC-Lo-173（5.55±0.69）;DTC-Lo-171 免疫鸡群后第 5 周 HI 抗体效价（Log2）达到峰值（6.80±0.45）,与 DTC 免疫组（7.20±1.09）和 DTC-Lo-173 免疫组（6.80±0.84）相当,并于免疫后第12周下降至3.60±1.52,DTC组降为3.20±1.64,DTC-Lo-173组降为2.00±1.00。为评价H5亚型AIV标记疫苗候选株的保护效力,免疫后进行了攻毒保护试验。结果显示,DTC-Lo-171和DTC-Lo-173免疫组均能对母本毒株DTC和流行毒株JYD的攻毒提供100%的发病保护,且DTC-Lo-171的排毒保护率（100%）优于DTC-Lo-173（70%）。应用上述建立的竞争ELISA方法,对疫苗候选株免疫21 d血清和免疫后两株强毒攻毒14 d血清开展DIVA特性评价,结果显示,DTC免疫血清（39.86%）和免疫后攻毒血清（45.19%和50.21%）的抑制率均呈阳性,而DTC-Lo-171（13.96%）和DTC-Lo-173免疫血清（14.53%）的抑制率均呈阴性,母本毒株DTC（38.67%和38.63%）和流行毒株JYD（41.59%和41.81%）攻毒后血清抑制率均转为阳性。以上结果表明,DTC-Lo-171的抗原性、免疫原性、抗体水平及持续时间、免疫效力及攻毒保护效力均优于DTC-Lo-173,是一株较为理想的H5亚型标记疫苗候选株,免疫血清能被所建立的竞争ELISA方法识别,具有良好的DIVA特性。综上所述,本研究针对H5亚型AIV HA2蛋白特异性抗原表位H5-17th肽制备了McAb,其中具有ELISA特性和IFA特性的为3E10、3G6和4F8,而2C2、3C10和5G6仅具有IFA特性,其对H5亚型毒株具有较好的特异性和广谱性。选取具有较高抑制率的IgG1亚类McAb 3E10作为竞争单抗建立了区分H5亚型AIV标记疫苗免疫血清和野毒感染血清竞争ELISA方法,该方法对H5亚型血清具有良好的特异性和广谱性反应性。DTC-Lo-171能够诱导产生良好的免疫应答,针对H5亚型母本毒株和流行毒株攻毒能够提供100%的发病保护和排毒保护,且通过所建立的竞争ELISA方法能够有效区分疫苗免疫血清和野毒感染血清,是一株理想的H5亚型AIV标记疫苗候选株。