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猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一。此外,PPV还能引起仔猪腹泻、皮炎以及呼吸系统疾病,在猪非化脓性心肌炎、猪消瘦综合症和仔猪断奶多系统衰竭综合症等疾病中也发挥着重要的作用。全球普遍存在着猪细小病毒病,严重影响养猪业的发展,对其造成了巨大的经济损失。MicroRNAs是一类由内源基因编码的长度为19-24nt的单链RNA分子,其通过与靶基因mRNA 3’UTR相互作用,在病毒的侵染、细胞的增殖分化及凋亡、肿瘤的发生、体内平衡等许多生物学过程中起着重要的调控作用。目前,关于细胞miRNAs调节病毒感染的研究已有报道,其中包括乙型脑炎病毒,猪繁殖与呼吸综合症病毒,丙型肝炎病毒,A型流感病毒,猪瘟病毒等,但对于PPV感染PK-15细胞诱导细胞miRNAs表达却未见报道。为了探究细胞miRNAs在PPV感染中的作用,本试验通过测定PPV的TCID50,在刚贴壁的PK-15细胞中按照1个MOI接种PPV,并于感染24h后对细胞进行总RNA的抽提,通过Solexa高通量测序方法筛选出符合要求的miRNAs,并对PPV感染前后细胞miRNAs的表达量进行测定。同时根据PPV NS1的保守序列设计了一对荧光定量检测引物,建立了PPV荧光定量PCR方法。通过软件预测能靶向PPV基因组的miRNAs,并将其与免疫有关的miRNAs共同转染PK-15细胞,运用建立的荧光定量方法对其功能进行了验证。通过Solexa高通量测序结果表明,共有476条miRNAs在PPV感染前后表达量有所改变,其中240条miRNAs是对照组数据库所特有的,13条miRNAs是试验组数据库所特有的。对建立的细胞miRNAs表达谱进行分析发现,共有182条miRNAs差异表达,其中60条miRNAs属于上调表达,122条miRNAs属于下调表达。miR-21是表达量最大的,而miR-10b是差异最大的。对差异表达的miRNAs的靶标进行预测发现,C-JUN、MyD88、TLR7等与免疫有关的基因被预测出来,这结果表明这些差异表达的miRNAs可能参与PPV感染过程。通过实时荧光定量验证了随机挑选的10个差异表达的miRNAs,其结果全部与Solexa高通量测序结果致。所建立的荧光定量PCR最佳退火温度为59℃,其在1.59×109-1.59×104copies/μL可得到较为理性的标准曲线,相关系数R2为0.997,扩增效率为97.2%,且其特异性和重复性都很好,能被运用于miRNAs 功能试验的验证。PPV基因组靶标预测结果显示,miR-34a能靶向PPV NS1的编码区,且该编码区在PPV病毒中属于高度保守序列。荧光定量PCR结果显示,miR-34a能抑制PPV的复制,而其他的miRNAs则不能,但其具体的抑制机制仍需要进一步的研究。本试验成功构建了猪PK-15细胞的小RNA数据库,并建立了PPV感染前后细胞miRNAs的表达谱,对其差异表达的miRNAs及其靶标分析,有助于在miRNAs的层面上了解PPV感染机制以及宿主抗病毒免疫的分子机制。本试验同时也证实了miR-34a能抑制猪细小病毒的复制,这为PPV的防治提供了一条新思路。