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目的:干细胞因具有自我更新能力和多向分化潜能而在细胞治疗和组织再生中具有重要应用价值。然而干细胞内部组成并非均一,而是由不同表型及功能的亚群组成,这种异质性组成造成了干细胞实际应用中的疗效不稳定性。干细胞内部各亚群因较为单一的表型而表现出特异性分化优势,可能是更为理想的种子细胞。但是亚群单独应用意味着破坏原有的异质性微环境,而已有研究证实干细胞异质性对细胞和组织功能活动有重要意义,因此干细胞亚群分离后,是否会因脱离异质性微环境而易发细胞衰老可能影响其作为种子细胞的应用前景。为探究这一问题,本课题分离培养人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,H-DFSCs),并从干细胞异质性微环境中分离亚克隆,通过对比亚克隆和正常培养的异质性H-DFSCs的衰老进程,观察干细胞异质性微环境改变对内部亚群细胞衰老的影响,以期为组织再生中干细胞亚群的长远应用提供新的思路。方法:本课题采用酶消化法和组织块培养法联合处理H-DFSCs,通过流式细胞术进行干细胞表面分子鉴定,克隆形成实验测定集落生成能力,成骨、成脂向诱导验证多向分化潜能。所获H-DFSCs行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检验异质性,有限稀释法挑选亚克隆,连续扩增传代后筛选具有增殖能力的亚克隆群体,CCK-8及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术分析细胞周期分布,β-半乳糖苷酶染色计算衰老细胞阳性率,并通过q RT-PCR技术检测细胞内衰老相关基因TP53、CDKN1A、CDKN2A、MAD2L1和BUB1B的m RNA表达水平。以上所有衰老相关检测结果以与亚克隆相同代数和相似培养周期的异质性H-DFSCs作为对照。结果:1、本实验利用酶消化法结合组织块培养法分离得到H-DFSCs,光学显微镜下观察第三代H-DFSCs主要为梭形,流式细胞术检测间充质干细胞表面标记CD90、CD146表达阳性,造血干细胞表面标记CD34、CD45表达阴性,平板克隆形成能力强,经体外诱导后可向成骨及成脂方向分化。2、H-DFSCs平板克隆形成结合ALP染色显示阳性、弱阳性、阴性三种结果。有限稀释法筛选后得到H-DFSCs的三种增殖11代的亚克隆DF1、DF2和DF3,细胞形态分别为梭形、长条形和多角形。3、CCK8结果显示,与相同培养代数的第11代异质性H-DFSCs(P11)相比,亚克隆DF1表现出较强的增殖能力,而DF2、DF3增殖能力较弱,DF3最差;克隆形成实验表明,DF2、DF3集落形成能力显著低于P11,DF1与P11相似但略高于第16代异质性H-DFSCs(P16),而第21代异质性H-DFSCs(P21)集落形成率最高。4、细胞周期结果显示,DF1的G1期细胞比例与P11相似,DF2和P21拥有的更少比例的G1期细胞和更多比例的S期细胞,DF3和P16的G1期细胞比例较高,DF3最高。5、β-半乳糖苷酶染色结果显示,P11衰老率极低,P16衰老细胞开始增加,P21时显著增加,而亚克隆DF1、DF2和DF3衰老细胞阳染率均显著高于P11甚至P21。6、qRT-PCR结果显示,H-DFSCs衰老相关基因TP53、CDKN1A和CDKN2A在P16表达升高后又在P21降低,有丝分裂检查点MAD2L1基因在P16有所增加,P21仍维持较高表达水平,BUB1B基因表达未见明显变化。而亚克隆DF1、DF2和DF3衰老相关基因TP53、CDKN1A和CDKN2A表达均显著高于P11,MAD2L1和BUB1B表达均显著低于P11。结论:本实验获取得到有良好增殖能力和多向分化潜能的H-DFSCs,通过有限稀释法成功分离得到三种单细胞来源的亚克隆,亚克隆间表现出不同的生物学行为。与异质性的H-DFSCs相比,亚克隆表现出更早的细胞衰老,且衰老后修复能力显著降低,表明干细胞异质性微环境对维持亚克隆正常生物学行为具有重要作用,破坏异质性环境可显著影响亚群细胞生物学潜能,研究者应在应用前予以考虑。