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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于水痘病毒属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员,是伪狂犬病病原,能感染多种哺乳动物引起发热、奇痒、脑脊髓炎等症状,给家猪养殖业造成巨大经济损失。我国是猪肉消费大国,伪狂犬病严重危害我国养猪业的健康发展。伪狂犬病在国内的首次记录出现于1948年,并在上世纪八十年代广泛流行,造成大量怀孕母猪流产,PRV Ea株便是在当时分离得到的。PRV Ea株由于具有高致病性和强免疫原性而被广泛研究,既可作为表达其病基因的活病毒载体,也是研究PRV毒株遗传进化关系的参考毒株,还是作为研究病毒宿主相互作用的模式生物,被认为是PRV国内参考株。为控制PRV在国内的蔓延,匈牙利弱毒疫苗株Bartha在上世纪60年代被引入中国,同时随着Ea株等国内毒株的分离、鉴定,多种基于国内本土PRV毒株构建的基因缺失疫苗也得到大力发展,在这些弱毒疫苗和基因缺失疫苗的广泛使用下,PRV在我国的传播被有效控制。然而自2011年年底之后,伪狂犬病在我国多个省份疫苗接种过的猪场再次爆发,分离鉴定得到多株PRV变异株。为进一步了解近年国内伪狂犬病再次爆发的原因,本论文对国内参考株Ea与变异株HNX、弱毒疫苗株Bartha的生物学功能差异进行了比较。通过三代测序技术PacBio结合二代测序技术Illumina获得经典株Ea的全基因组序列,进化比对分析确认了PRV变异株与包括Ea株在内的国内早期毒株亲缘关系较近,证明变异株是从早期国内毒株演变而来,PRV在国内的进化不依赖国外毒株。Ea株与变异株空斑大小有显著差异,虽然病毒蛋白质氨基酸序列同源性较高,但其病毒粒子组分和感染细胞后病毒各蛋白表达量存在差异,蛋白表达水平的差异可能是造成两者致病力不同的原因。PRV能在自然宿主体内建立终身潜伏感染。在潜伏期,病毒在宿主三叉神经节内表达大量潜伏相关转录物LLT。研究发现PRV LLT Intron能编码11个成簇存在的miRNAs,靶基因预测结果显示这些miRNAs可能参与调节病毒与宿主多个基因的表达,体外实验证明PRV LLT miRNA簇与病毒增殖能力和诱导凋亡的能力有关,参与调控病毒IE180和EP0蛋白的表达。但是,关于PRV LLT miRNA簇在宿主体内的功能仍不清楚,为进一步探究PRV LLT miRNA簇与病毒毒力的关系,本研究以PRV感染的天然宿主猪为对象,通过临床症状观察、鼻眼试子病毒分离、血清学检测、三叉神经节病毒拷贝数检测等方法比较分析了miRNA簇缺失株与野毒株的差异,结果发现病毒缺失miRNA簇后引起的临床症状、排毒能力和免疫应答水平都有所减弱,证明miRNA簇与病毒毒力有关。本研究还发现,LLT mi RNA簇真核表达质粒在体外可不依赖于病毒基因而独立编码miRNAs,且免疫小鼠后能提高小鼠抗病毒能力。由此认为,PRV LLT miRNA簇与病毒神经毒力和致病力有关,miRNA簇是病毒的一个毒力因子。为进一步深入研究PRV miRNA簇中各个miRNA的功能,需要构建单个mi RNA突变株。考虑到通过传统同源重组方法构建病毒突变株较为费时费力,为提高突变株的构建效率,本研究构建了PRV Ea株细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)克隆,为后续研究PRV各基因功能提供了便利。在PRV BAC平台基础上通过两步法Red重组技术构建了PRV miRNA7缺失突变株PRV-ΔmiR7及回复突变株PRV-ΔmiR7-R,空斑大小比较结果显示miRNA7缺失后病毒空斑减小,证明miRNA7与病毒增殖能力有关。