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资源过度开发带来的环境污染导致生态环境急剧恶化,这可能与近年人类生殖能力的急速下降有关。已有的体内/体外实验结果显示多环芳烃家族的多个成员均能引起生殖健康问题。7,12-二甲基苯并蒽是多环芳烃类化学物质中的一员(7,12-dimethylbenz(a)anthracene,DMBA),能破坏啮齿类动物卵巢中各发育阶段卵泡。但其对于卵母细胞减数分裂成熟的影响仍不清楚,尤其是在大动物(猪)模型上仍是空白。卵母细胞减数分裂成熟包括核成熟,胞质成熟和核质成熟的协同性三个方面。本研究中,利用猪卵母细胞体外成熟系统,我们研究了DMBA对卵母细胞减数分裂成熟的影响,并试图解析其影响机制,从而增加人们对环境污染物影响生殖的了解。主要研究结果如下:(1)不同浓度DMBA(10μM和20μM)成熟培养猪卵丘-卵复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)和裸卵(cumulus-denuded oocytes,DOs),结果显示20μM DMBA提高COC组44 h卵母细胞第一极体排出率(88.2%vs.76.4%,P<0.05),而10μM DMBA没有显著改变(83.0%vs.76.4%,P>0.05)。10μM和20μM DMBA不影响裸卵组44 h卵母细胞第一极体排出率(69.7%,73.5%vs.77.1%;P>0.05)。进一步剖析COC组核进程发现20μM DMBA处理显著升高18 h GVBD率(35.1%vs.19.5%,P<0.05),而显著降低24 h GVBD率(61.3%vs.74.7%,P<0.05)。甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)抑制COC组的缝隙连接显著降低20μM DMBA提高的极体排放率(64.1%vs.87.0%,P<0.05),但对DO组的极体排出率没有影响(68.3%vs.71.0%,P>0.05)。这些结果表明卵丘细胞可能通过缝隙连接介导DMBA对猪卵的核成熟效应。免疫印迹试验发现20μM DMBA显著升高COC组卵母细胞中的p ERK1/2(T202/Y204)的水平(1.2 vs.1.0,P<0.05),但不改变p CDK1(T161)的水平(1.0 vs.1.0,P>0.05)。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路抑制剂U0126降低20μM DMBA诱导的COC组第一极体排出升高效应(24.4%vs.94.2%;P<0.05)。磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)信号通路抑制剂U73122也具有类似的效应(80.5%vs.94.2%;P<0.05)。但AHR信号通路抑制剂Alpha-NF不能改变DMBA的促第一极体排出效应(89.8%vs.90.7%;P>0.05)。这些结果说明,卵丘细胞通过影响COC组猪卵母细胞中的PLC和MAPK信号通路介导20μM DMBA对核成熟的效应。(2)20μM DMBA显著下调COC组卵母细胞的H3K9me3(0.6 vs.1.0;P<0.05)和H3K27me3水平(0.6 vs.1.0;P<0.05),显著上调H3K36me3水平(1.3 vs.1.0;P<0.05),使卵母细胞基因组处于相对激活状态。RT-q PCR结果显示20μM DMBA显著下调G9a(0.8vs.1.0;P<0.05)和Eed(0.8 vs.1.0;P<0.05)mRNA的丰度。在DO系统中,20μM DMBA不影响卵母细胞中H3K9me3,H3K27me3和H3K36me3的水平。20μM DMBA能显著增强COC组卵母细胞中的γH2A.X免疫荧光信号(2.9 vs.0.5;P<0.05)和蛋白水平(1.3 vs.1.0;P<0.05),但在DO系统中并不影响γH2A.X免疫荧光信号(0.6 vs.0.7;P>0.05)。Annexin V检测卵母细胞凋亡发现20μM DMBA显著提高COC组卵母细胞的凋亡比例(41.5%vs.13.9%;P<0.05),但不影响DO组卵母细胞的早期凋亡(11.3%vs.13.9%;P>0.05)。这些结果表明,卵丘细胞介导了DMBA诱导的卵母细胞染色体相关事件,以及其下游事件的改变效应,如组蛋白修饰状态,DNA双链断裂损伤和其可能导致的早期凋亡事件。(3)对于卵母细胞胞质成熟,20μM DMBA显著提高COC和DO组卵母细胞内的氧化应激水平(COC,7.6 vs.1.0,P<0.05;DO,13.8 vs.1.0,P<0.05),显著降低线粒体膜电位水平(COC,0.7 vs.1.0,P<0.05;DO,0.9 vs.1.0,P<0.05)。有趣的是我们还发现DMBA处理诱导COC和DO组卵母细胞(12,18,24,44 h)胞质产生蓝色荧光物质。这些结果表明,DMBA处理通过提高氧化应激,降低线粒体功能,产生过多的荧光物质损害卵母细胞胞质成熟。(4)20μM DMBA抑制COC周围卵丘细胞的扩展(24 h,2.3 vs.1.4,P<0.05),促进卵丘的脱落(44 h,1.2 vs.0.9,P<0.05),诱导卵丘细胞DNA损伤,但并不引起卵丘细胞凋亡。这些结果表明20μM DMBA改变卵丘细胞的状态和分子通路,进而间接影响卵母细胞的核质成熟。(5)利用孤雌激活评价DMBA处理后成熟卵母细胞的发育潜能,结果表明20μM DMBA处理显著降低孤雌胚胎的卵裂率(COC,21.7%vs.86.2%,P<0.05;DO,28.8%vs.81.4%,P<0.05)和囊胚率(COC,0%vs.26.6%,P<0.05;DO,0%vs.13.9%,P<0.05)。处理组的多数孤雌胚胎阻滞在1细胞期(COC,78.3%vs.12.9%,P<0.05;DO,71.2%vs.18.6%,P<0.05),没有囊胚形成。染色发现阻滞的1-cell孤雌胚胎具有1-6个原核,没有MⅡ中期的染色体。这些结果指示DMBA处理成熟期的卵母细胞抑制成熟后卵母细胞的发育潜能,尽管这些成熟的卵母细胞可以被激活形成原核。综上所述,DMBA处理影响猪卵母细胞的核成熟,胞质成熟和核质成熟的协同性,破坏成熟卵母细胞的后续发育潜能。在DMBA诱导的效应中,对卵母细胞核成熟及其相关事件的影响是由卵周围的卵丘体细胞通过缝隙连接调控卵母细胞内部的PLC,MAPK,DNA损伤和组蛋白甲基化来实现的。不管卵丘细胞是否存在,DMBA都能通过诱导氧化应激,破坏线粒体功能和产生荧光物质影响胞质成熟。本研究的结果为DMBA影响雌性生殖提供了新的研究信息和思路。