研究背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是呼吸系统的常见病。吸烟是COPD最主要的危险因素,但其确切的致病机制尚未阐明。细胞焦亡的特征是可以释放大量炎症因子,最终引起强烈的炎症反应。细胞焦亡的发生主要由活化的炎症小体介导,同时伴随着GSDMD（Gesdermin D）的切割、白介素（IL）-1β和IL-18的释放。NLRP3作为研究最广泛的炎症小体,已证实在COPD患者肺组织中高表达;敲减NLRP3可抑制香烟烟雾引起的支气管上皮细胞焦亡及炎症反应,发挥对支气管上皮细胞的保护作用。吸烟可以导致肺部氧化应激反应的发生,促进活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）的增多从而促进炎症小体的活化。TXNIP是氧化应激的调节剂,在氧化应激发生时可与NLRP3传感器C末端的富含亮氨酸重复（Leucine-Rich Repeats,LRR）结构域相互作用,促进NLRP3炎症小体的激活。Nrf2是氧化还原敏感性转录因子,可增强抗氧化酶（GST、HO-1和NQO1）的转录从而调节ROS水平。白藜芦醇具有抗氧化特性,体内外研究均已证实它在肺部疾病中的抗炎和抗氧化作用。综合以上,我们推测Nrf2可能通过ROS水平调控TXNIP的表达,影响炎症小体的活化,参与香烟烟雾引起的支气管上皮细胞焦亡。本研究拟阐明:1.香烟烟雾能否引起支气管上皮细胞焦亡及炎症反应;2.香烟烟雾如何导致支气管上皮细胞焦亡及炎症反应;3.白藜芦醇能否抑制香烟烟雾诱导的支气管上皮细胞焦亡及炎症反应?如果可以,是以何种方式发挥作用的?方法:1.梯度浓度的香烟烟雾提取物（Cigarette Smoke Extract,CSE）处理支气管上皮细胞,RT-qPCR及Western Blotting检测细胞焦亡相关分子的表达;乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）释放实验及碘化丙锭（Propidium Iodide,PI）染色检测细胞焦亡的水平;酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测细胞上清液中炎症因子的表达。此部分拟阐明CSE引起支气管上皮细胞焦亡和炎症反应。2.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时,加用VX-765（一种caspase-1抑制剂）后,用上述方法检测细胞焦亡及炎症因子表达,明确caspase-1在CSE引起支气管上皮细胞焦亡中的作用。3.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时后,使用小干扰RNA（siRNA）敲减支气管上皮细胞中NLRP3的表达,RT-qPCR及Western Blotting验证siRNA的敲减效率;检测干扰组和干扰对照组细胞中caspase-1的表达;LDH释放实验及PI染色检测si-NLRP3组及si-NC组细胞焦亡水平的变化;ELISA检测si-NLRP3组及si-NC组细胞上清液中炎症因子的表达。明确NLRP3对caspase-1的影响及其在CSE导致的气道上皮细胞焦亡中的作用。4.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时,加用N-乙酰半胱氨酸（NAC）（一种ROS清除剂）。活性氧试剂盒检测ROS水平;RT-qPCR检测NLRP3的表达;caspase-1试剂盒检测caspase-1的活性;LDH释放实验及PI染色检测细胞焦亡的变化;ELISA检测细胞上清液中炎症因子的表达。明确ROS水平对NLRP3和caspase-1的影响,及其在CSE导致的气道上皮细胞焦亡中的作用。5.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时,RT-qPCR及Western Blotting检测TXNIP的表达。随后5%CSE处理支气管上皮细胞24小时,使用siRNA敲低支气管上皮细胞中TXNIP的表达,检测si-TXNIP组及si-NC组细胞的ROS水平、细胞焦亡相关分子的表达。此部分拟明确TXNIP对NLRP3表达的影响,及其在CSE诱导的支气管上皮细胞焦亡的作用,同时阐明ROS与TXNIP的上下游关系。6.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时,检测Keap1、Nrf2及依赖Nrf2的抗氧化酶（GST,HO-1和NQO1）的表达。5%CSE处理支气管上皮细胞24小时后加用tBHQ（一种 Nrf2 激活剂）,Western Blotting 检测 Nrf2、GST、HO-1 和 NQO1 的表达,TXNIP、NLRP3及细胞焦亡相关分子的表达;活性氧试剂盒检测ROS水平;RT-qPCR检测TXNIP、NLRP3及细胞焦亡相关分子的表达;ELISA检测炎症因子的表达。阐明Nrf2对ROS及TXNIP的影响,明确Nrf2在CSE诱导支气管上皮细胞焦亡中的作用。7.5%CSE处理支气管上皮细胞24小时后加用tBHQ,检测Keap1的表达。5%CSE处理支气管上皮细胞24小时后使用siRNA敲低支气管上皮细胞中Keap1的表达,Western Blotting检测Nrf2、GST、HO-1和NQO1的表达;活性氧试剂盒检测ROS水平;ELISA检测炎症因子的表达。拟阐明Keap1对Nrf2的调控及其对ROS的影响,明确Keap1在CSE诱导支气管上皮细胞焦亡中的作用。8.香烟烟雾暴露联合鼻腔滴入LPS构建肺气肿小鼠模型,通过小鼠肺组织切片的HE染色,观察不同组小鼠肺组织的形态学改变,验证造模是否成功;肺气肿小鼠造模成功后,免疫组织化学染色（IHC）检测小鼠肺组织中NLRP3、TXNIP及细胞焦亡相关分子的表达;ELISA检测小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β和IL-18的水平;Western Blotting及RT-qPCR检测小鼠肺组织中抗氧化分子、细胞焦亡相关分子及炎症因子的表达。9.不同浓度的白藜芦醇对5%CSE处理后的支气管上皮细胞进行预处理,活性氧试剂盒检测各组细胞的ROS水平;RT-qPCR及Western Blotting检测各组细胞Nrf2、GST、HO-1和NQO1、TXNIP及细胞焦亡相关分子的表达;ELISA检测细胞上清液中的炎症因子水平。20μM白藜芦醇对5%CSE刺激后的支气管上皮细胞进行预处理后,加用NAC（5mM）,检测三组（CSE,CSE+白藜芦醇,CSE+白藜芦醇+NAC）细胞中上述指标的变化。拟明确白藜芦醇通过Nrf2影响ROS水平进而调控TXNIP,最终抑制细胞焦亡及炎症反应。结果:1.梯度浓度CSE处理支气管上皮细胞后,NLRP3及caspase-1的表达随CSE浓度的增加逐渐升高;LDH释放及PI染色阳性细胞比例逐渐增加;细胞上清液中IL-1β和IL-18水平也明显升高。2.与CSE组相比,5%CSE+VX-765组细胞的LDH释放水平及PI染色阳性细胞比例显著降低,细胞上清液中IL-1β和IL-18水平明显降低。3.5%CSE处理支气管上皮细胞后,si-NLRP3组显著降低了支气管上皮细胞的LDH释放水平及PI染色阳性细胞比例;还降低了细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达;但未能影响caspase-1的表达。4.与CSE组相比,CSE+NAC组细胞的ROS水平降低;NLRP3表达及caspase-1活性降低;LDH释放水平及PI染色阳性细胞显著降低;也降低了细胞上清液中IL-1β和IL-18的水平。5.5%CSE处理支气管上皮细胞后,TXNIP表达升高。TXNIP敲低后的支气管上皮细胞的ROS水平无明显变化,NLRP3及细胞焦亡相关分子表达降低,细胞焦亡及炎症反应受到了抑制。6.5%CSE处理支气管上皮细胞后,Keap1表达上升,Nrf2及GST,HO-1和NQO1的表达下降。5%CSE处理支气管上皮细胞加用tBHQ后,Nrf2、GST、HO-1和NQO1的表达进一步下降,TXNIP、NLRP3及细胞焦亡相关分子表达下降,ROS水平降低,抑制了细胞焦亡及炎症反应。7.5%CSE处理支气管上皮细胞并加用tBHQ后,Keap1表达无明显改变。Keap1敲减后,Nrf2、GST、HO-1和NQO1的表达增高,同时抑制了 ROS的生成及炎症因子的表达。8.香烟烟雾暴露组小鼠肺组织切片HE染色结果表明肺气肿模型建立成功。IHC染色结果显示肺气肿小鼠肺组织中NLRP3、TXNIP及细胞焦亡相关分子的表达升高。ELISA结果表明肺气肿小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8水平升高。Western Blotting结果表明肺气肿小鼠肺组织中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD的蛋白表达增高;除Keap1外,Nrf2、GST、NQO1和HO-1的蛋白表达均下降。RT-qPCR的结果表明mRNA表达规律与Western Blotting一致。肺气肿小鼠血清中IL-1β以及IL-18的水平明显高于对照组。9.白藜芦醇+CSE组支气管上皮细胞的ROS水平较CSE组降低,TXNIP、细胞焦亡相关分子及炎症因子的表达较CSE组降低;与CSE组相比,白藜芦醇+tBHQ处理组支气管上皮细胞中ROS水平下降,TXNIP及细胞焦亡相关指标的表达也下调,但Nrf2、GST、HO-1和NQO1的表达升高。表明白藜芦醇通过ROS抑制细胞焦亡的发生。结论:1.CSE促进支气管上皮细胞ROS的产生,增强NLRP3炎症小体的激活及caspase-1的活化,促进细胞焦亡及炎症反应的发生。2.Nrf2可抑制ROS的产生,减弱TXNIP与NLRP3的作用,导致caspase-1的活化受阻,在CSE引起的支气管上皮细胞焦亡及炎症中起保护作用。3.白藜芦醇可增强支气管上皮细胞Nrf2表达,促进抗氧化酶（GST,HO-1和NQO1）的转录从而减少ROS的生成,削弱TXNIP与NLRP3的相互作用,导致caspase-1活化受阻,抑制了 CSE引起的细胞焦亡及炎症反应。