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目的:自1977年发现以来,蛋白激酶C(PKC)作为细胞内信号转导体系中的一个重要激酶,参与了细胞内的不同类型的生命形式,包括细胞的生长、细胞分化,进而调节细胞周期,PKC参与的细胞调亡可能和肿瘤发生有关,在很多疾病的发生发展过程中也起到重要作用。PKC的多种亚型在不同细胞中的定位、表达和功能的不同,为PKC能够在多种信号传递系统中发挥作用提供了重要基础和保证,由于细胞可以同时合成不同亚型的PKC,导致PKC参与生长调控的分子机制变得更加复杂和多样化。细胞周期的调控是一个复杂的过程,受控于多种磷酸酶与磷酸激酶作用下的中心调控体系。作为PKC家族的一员,PKCδ是参与细胞内外信号转导的一个重要激酶,因此,探讨PKCδ信号通路在细胞周期调控中的作用,具有重要意义。Cdks是周期蛋白(cyclin)依赖性激酶,与周期蛋白结合活化后,共同对细胞周期进行调节。在细胞周期中,cdks参与调控G2/M的转换。Cyclin作为cdks的调节亚基,与其结合后形成Cyclin/cdk复合物,当cdks处于活化状态时,从而发挥对细胞周期的调控作用。MPF为异二聚体,是G2/M转换的调节者,由Cdc2和CyclinB构成。有丝分裂前,由于Cdc2的Tyr15和Thr14残基发生磷酸化,Cdc2处于失活状态,形成M期促进因子(MPF)的无活性前体,在有丝分裂期MPF可以被Cdc25活化,这两个位点被去磷酸。G2向M期的转换离不开Cdc2的调控,在Cdc25B磷酸酶的作用下,Cdc2发生去磷酸化后被激活,从而激活MPF,使早期有丝分裂开始启动。卵母细胞能够快速恢复到减数分裂的进程中去,也主要受到Cdc25B的调节。小鼠受精卵的早期发育过程,尤其是1-细胞期向2-细胞期的转换机制是国际上研究的热点和难点。PKCδ在MⅡ,2-细胞期小鼠受精卵中均被检测到,但它对受精卵早期发育调控机制少有报道,本实验室前期研究表明PKC可通过激活MPF促进小鼠受精卵的发育,且PKC在M期的活性增强,还有研究认为PKCδ组成了PKC活性的大部分,PKCδ在M期的表达量增多很可能和PKC在M期的活性增强有关,本实验以小鼠1-细胞期受精卵为研究对象,观察了PKCδ在小鼠1-细胞期受精卵四个分期中的mRNA和蛋白水平的表达及定位,并利用PKCδ的抑制剂Rottlerin以及特异性的siRNA处理1-细胞期受精卵,观察受精卵细胞的分裂情况,探讨了PKCδ在小鼠受精卵早期发育过程中的作用及其机制。应用Scansite软件预测Cdc25B-Ser96(96位丝氨酸)可能为PKCδ特异性磷酸化位点,在哺乳动物细胞内Cdc25B是否为PKCδ的直接作用底物,Cdc25B-Ser96对小鼠受精卵细胞周期的调节作用尚未见报道。因此,进一步观察PKCδ/Cdc25B信号转导通在小鼠l-细胞期受精卵发育中的调控作用,尤其是G2/M转变过程中对Cdc25B和MPF的调控作用,对阐明PKCδ调控哺乳动物细胞周期的机制有重要意义。研究方法:本研究选用昆明系SPF级小鼠,雌性4-6周,20-24g,雄性8周,30-35g,都来自于中国医科大学实验动物中心,通过分别对小鼠进行腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin,PMSG)及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)超排卵和受精,取小鼠受精卵放入M16培养液中培养至指定时间收集G1,S,G2,M期受精卵,分别设置实验组和对照组,进行如下研究:(1)Real time-PCR观察PKCδ在1-细胞期小鼠受精卵各期中的表达。(2)Western-blot观察PKCδ在1-细胞期小鼠受精卵各期中的表达。(3)间接免疫荧光实验观察PKCδ,Cdc25B蛋白的亚细胞定位。(4)在经PKCδ特异性抑制剂预处理和PKCδ特异siRNA显微注射的条件下,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(5)用Cdc25BSer96的特异性磷酸化抗体检测在Cdc25B分别在G1,S,G2,M期的磷酸化状态。(6)预测PKCδ潜在底物的磷酸化位点,以pBSK-Cdc25B-WT为模板用定点突变技术构建Cdc25B模拟磷酸化和去磷酸化的突变体,在体外将各突变体转录成mRNA。(7)将体外转录Cdc25B-mRNAs分别显微注射到G1期受精卵中,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(8)在抑制剂Rottlerin存在的条件下,抑制PKCδ活性,显微注射Cdc25B-mRNAs,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。(9)PKCδ-siRNA与Cdc25B-mRNAs共同显微注射到各期受精卵中,测定Cdc25B蛋白表达水平,观察小鼠受精卵的卵裂率并测定MPF活性,Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。结果:1、PKCδ在小鼠受精卵各个时期(G1,S,G2,M)mRNA和蛋白水平均表达,且在M期的表达明显高于其他时期,蛋白表达与mRNA水平表达一致,且PKCδ在M期的活性较强,亚细胞定位显示PKCδ,Cdc25B在各期均有分布。2、抑制PKCδ活性,卵裂率下降,MPF活性降低,小鼠受精卵的发育受到抑制。siRNA显微注射,降低小鼠受精卵的卵裂率,降低MPF活性,抑制受精卵的分裂。3、在G2,M期可以检测到Cdc25BSer96的磷酸化条带,表明Cdc25BSer96在G2,M期被磷酸化。4、显微注射Cdc25B-S96D(Asp)-mRNA能提前激活MPF,明显促进受精卵卵裂。5、当PKCδ活性受到抑制时(rotterlin存在条件下,或siRNA显微注射),显微注射Cdc25B-S96D-mRNA可逆转PKCδ活性受到抑制时引起的G2/M期阻滞,促进1-细胞期受精卵发育。结论:1、PKCδ在在1-细胞期受精卵的各个时期均表达,且在M期的表达量明显增多活性增强。2、PKCδ的特异性抑制剂和siRNA显微注射延迟MPF的激活,进而抑制小鼠受精卵的G2/M期转换,降低卵裂率,PKCδ对小鼠受精卵的发育起正调控作用。3、Cdc25BSer96在G2,M期被磷酸化,显微注射模拟Ser96磷酸化的Cdc25B-mRNA可以明显促进受精卵的发育,PKCδ/Cdc25B通路对小鼠受精卵的发育有重要的调控作用。Cdc25B可能是PKCδ作用的直接底物,PKCδ通过对Cdc25B96位Ser的磷酸化修饰,激活MPF,从而促进G2/M期转换。