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目的(一)研究Exendin-4对成熟大脑脑室下区中的神经干细胞增殖和分化的促进作用和相关机制。(二)研究Exendin-4对Nogo-A-Δ20介导的细胞黏附铺展和神经突生长抑制的保护作用。方法(一)取5周龄C57小鼠,提取纯化脑室下区的神经干细胞并进行鉴定,使用shRNA敲除GLP-1R,并用WesternBlot验证其敲除效果,使用敲低GLP-1R的神经干细胞进行后续实验以研究Exendin-4对其增殖和分化的影响,使用10nM,50nM,100nM,250nM的浓度梯度的Exendin-4,并用CCK8和WesternBlot检测其增值效果,使用免疫荧光和WesternBlot鉴定分化物中细胞的表型,通过免疫荧光计数阳性细胞数来判断其分化趋势,并在敲除GLP-1R后再次验证Exendin-4的促神经元分化效果。使用PI3K和MAPK阻断剂处理神经干细胞,WesternBlot检测其中AKT/CREB的活化以及BDNF的表达来探明其可能的下游机制。(二)培养SH-SY5Y细胞,用0,20,40,60,80,100 pmol/cm~2浓度的Nogo-A-Δ20对24孔板进行铺板处理后将细胞接种到涂覆有Nogo-A-Δ20的培养基底上,以鬼笔环肽染色和Image J软件分析其铺展面积来评估其对细胞黏附生长的抑制作用。采用siRNA敲低细胞GLP-1R的表达并用WesternBlot检测其效果,用150nM浓度的Exendin-4预处理细胞观察对Nogo-A-Δ20所介导的生长抑制的阻断作用,用全反式维甲酸培养SH-SY5Y诱导其分化,后使用150nM Nogo-A-Δ20处理分化后的SH-SY5Y以诱导其神经突塌陷。通过Exendin-4的预处理来观察其对Nogo-A-Δ20抑制神经突生长作用的阻断效果,并用GLP-1R敲低的细胞进行重复实验。免疫印迹检测细胞中blank组,Exendin-4组,GLP-1R敲低+Exendin-4组中RhoA和ROCK1的表达情况。用PI3K通路抑制剂,MAPK通路抑制剂,RhoA抑制剂和Rock1抑制剂处理细胞后检测RhoA的活化和表达以验证Exendin-4发挥作用的具体通路。结果(一)Exendin-4通过调节PI3K/AKT/CREB途径促进神经干细胞增殖并诱导其向神经元分化免疫荧光鉴定了成熟脑中脑室下区的神经干细胞以及其中GLP-1R的表达,CCK8和WesternBlot检测结果表明,Exendin-4通过GLP-1R显著促进了神经干细胞的增殖。而免疫荧光和WesternBlot检测发现在神经干细胞分化过程中Exendin-4能够显著提高其中的神经元表型细胞的比例,并且这一作用在使用shRNA敲除其受体GLP-1R或阻断PI3K通路后消失。免疫印迹检测Exendin-4激活了神经元中的AKT/CREB通路,进而提高了细胞内BDNF的表达来发挥促神经元分化作用,而这一信号级联依赖细胞内的PI3K而不是MAPK发挥作用。(二)Exendin-4通过PI3K途径下调RhoA保护细胞免受Nogo-A-Δ20所介导的生长抑制作用Nogo-A-Δ20可以显著抑制SH-SY5Y的铺展黏附,并且使神经突产生塌陷。Exendin-4的预处理可以保护细胞免受Nogo-A-Δ20所介导的细胞生长抑制作用。免疫印迹检测发现Exendin-4可以显著降低SH-SY5Y细胞内RhoA的表达以及活化,抑制PI3K通路能够阻断Exendin-4对RhoA的影响,而阻断MAPK通路并没有相似的作用。结论Exendin-4可能通过PI3K/AKT/CREB通路增加脑SVZ区神经干细胞的增殖,并在其分化过程中维持其神经元表型。并且可以通过PI3K通路降低细胞内RhoA的表达和活化来保护细胞免受Nogo-A-Δ20所介导的神经生长抑制作用。