植物寄生线虫给农业和林业造成巨大的经济损失，利用线虫的天敌-食线虫真菌对有害线虫进行防治受到广泛关注。本研究选取食线虫真菌的两个典型代表：捕食真菌少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora Fres.)和内寄生真菌厚垣普可尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)为研究对象，对食线虫真菌侵染线虫的分子机制进行了研究。　　 (一)少孢节丛孢(A.oligospora Fres.)差异蛋白组学分析　　 秀丽隐杆线虫(Caenorhabiditis elegans，strain N2)的提取物(C.elegans extract)能够有效诱导少孢节丛孢(A.oligospora Fres.)的捕食器官一三维菌网(adhesive nets)的形成。该提取物(C.elegans extract)为水溶性物质，而且其中三维菌网的有效诱导成份具有很好的热稳定性。少孢节丛孢(A.oligospora Fres.)三维菌网和营养菌丝的总蛋白通过二维电泳分离、PDQUest7.3.0软件分析、飞行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和KEGG功能分类鉴定后，对其进行了深入分析。　　 三维菌网形成条件下，菌网细胞的特征性酶过氧化氢酶(catalase)和相关蛋白的表达量增加。在A.oligospora Fres.基因组中有与黏附相关的蛋白(MAD1)具有同源性的两个蛋白。信号传导途径中，G蛋白βp亚基的表达量增加。此外，还检测到一些与细胞骨架和微生物与寄主识别有关的蛋白。　　 A.oligospora Fres.的基因组中具有8条介导真菌和线虫识别作用的凝集素(lectin)编码基因，这些lectin在糖蛋白的分泌途径和不同底物的识别过程中发挥着重要作用。三维菌网形成条件下，lectin(A0-1998-4)的表达量明显增加。　　 能量代谢相关蛋白的表达量在A.oligospora Fres.三维菌网形成条件下发生了明显变化。三羧酸循环和戊糖磷酸磷酸途径的中间代谢产物蛋白的表达量明显下降，与真菌致病性有关的乙醛酸循环的相关蛋白表达量增加。电子传递和能量合成相关的蛋白细胞色素c氧化酶(AO-2594-6)的表达量增加。AMPK(AO-2465-23)的表达量增加，该蛋白具有能量感应能力，能够促进脂肪酸氧化，抑制胆固醇和甘油三酯的合成，从而促进甘油的积累。氨基酸代谢相关蛋白和蛋白质合成调节相关因子的表达量在三维菌网形成条件下明显下降，提示三维菌网形成的诱导物质中含有大量的氨基酸。　　 在A.oligospora Fres.胞外蛋白的蛋白组学研究中，检测到胞外水解酶(蛋白水解酶和几丁质酶)及相关蛋白共19个。A.oligospora Fres.基因组中检测到8条几丁质酶编码基因，17条丝氨酸蛋白酶编码基因。这些水解酶在A.oligospora Fres.侵染、消解线虫的过程中发挥着重要作用。　　 (二)厚垣普可尼亚菌(P.chlamydosporia)侵染性几丁质酶的基因克隆、表达和功能鉴定　　 应用简并引物和DNA Walking技术克隆得到厚垣普可尼亚菌侵染性几丁质酶编码基因Pcchi44。该基因全长2，385 bp，含有3个内含子，编码一条含有424个氨基酸的多肽链，预测的分子量(Mr)和等电点(pI)分别为46.37 kDa和5.99。预测的氨基酸序列中包含2个糖基化位点(N-Y-S和N-A-T)和2个糖基水解酶18家族的保守序列SIGG和DGIDIDWE，分别代表底物结合位点和功能催化域。不同来源的几丁质酶同源性分析结果表明，PCCHI44与线虫病原真菌、昆虫病原真菌和重寄生真菌来源的属于糖基水解酶18家族的几丁质酶的氨基酸序列具有较高的同源性，这些酶具有相似的功能结构区。真菌和其它生物来源的几丁质酶系统发育分析表明，PCCHI44属于糖基水解酶18家族的亚族ClassV，与线虫病原真菌、昆虫病原真菌和重寄生真菌来源的几丁质酶具有较近的进化关系。　　 利用RT-PCR技术、酶切、连接等技术成功构建pET28a(+)/Pcchi44表达载体，并在表达菌株E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过Ni-NTA chelating、HiPrep16/10 Phenyl FF和Resource S纯化后得到纯的重组酶PCCHI44，分子量大小为44 kDa。重组几丁质酶PCCHI44的最适反应温度为50℃，最适反应pH值为6.0。PCCHI44的活性受到一系列金属离子的不同程度抑制(≥50%)，金属螯合剂EDTA对PCCHI44的活性没有影响。几丁质酶抑制剂caffeine，kinetsin，8-chlortheophylline和acetazolamide可以在不同程度上抑制PCCHI44的活性(52%-100%)，其中acetazolamide能够完全抑制PCCHI44的活性。乙醇对PCCHI44的活性有明显的抑制作用。用底物4-MU-(GlcNAc)3做底物，测得PCCHI44的Km值为9.65μM，Vmax为8.37×10-3μM s-1，Kcat讲为8.37 s-1。与未经酶处理的对照组相比，经纯的重组酶PCCHI44处理的根结线虫(Meloidogyne incognita)和家蚕(Bombyx mori)的卵形态结构发生了显著变化：卵壳表面有伤痕和不均一的脱落，卵内出现空泡。　　 论文的创新性主要体现为：　　 1)首次制备秀丽隐杆线虫和全齿复活线虫提取物(C.elegans extract& P.redividusextract)，这两种提取物都能够有效诱导少孢节丛孢(A.oligospora Fres.)三维菌网的形成；　　 2)利用差异蛋白组学技术首次研究了A.oligospora Fres.三维菌网和营养菌丝的蛋白表达差异，检测到与信号传导途径、细胞骨架、能量代谢和胞外水解酶等一系列与三维菌网形成和侵染线虫相关的蛋白；　　 3)首次从内寄生真菌厚垣普可尼亚菌(P.chlamydosporia)中克隆得到侵染性几丁质酶的编码全长基因(Pcchi44)，并将该基因在原核表达系统E.coli BL21(DE3)中成功表达。得到的重组几丁质酶PCCHI44能够侵染根结线虫(M.incognita)和家蚕(B.mori)的卵。