论文部分内容阅读
研究背景:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者数量增幅逐年加快,根据CK-NET的年度报告,我国接受肾脏替代治疗的尿毒症发病率达到了122.19/百万人口,通过自体动静脉内瘘（Arteriovenous fistula,AVF）进行血液透析是目前应用最广泛的治疗方法。目前的研究普遍认为内膜增生（Initimal hyperplasia,IH）是AVF中后期失功的主要原因,从IH形成机制上进行干预是最理想的治疗方法。血管内皮细胞（Vascular endothelial cell,EC）的损伤、血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMCs）增殖迁移、细胞外基质积聚及炎性细胞活化等都会参与内瘘血管新生内膜的形成,导致血管狭窄的发生。EC作为直接接触血液的细胞成分,一旦血液中血流动力学和成分改变都会造成EC损伤并产生一系列病理生理活动,继而影响附近的细胞。Hippo信号通路是细胞生长器官发育的一条重要通路,核心组件Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ）,具有调控EC细胞增殖分化。目前尚未有研究报道血管内皮细胞中Yap/Taz基因在AVF内膜增生中的作用,值得我们进一步探究。研究目的:1.探讨血管内皮细胞中YAP/TAZ表达在CKD动静脉内瘘狭窄过程的作用;2.探讨抑制血管内皮细胞中YAP/TAZ信号通路能否改善VSMCs的增殖,为内瘘狭窄的的治疗提供新靶点。研究方法:1.YAP蛋白在小鼠慢性肾脏病动静脉内瘘模型中的表达选择8周龄野生型C57/B6小鼠进行实验,分为非CKD组（non-CKD,8只）及CKD组（12只）。为提高动物存活率,CKD组小鼠分两次切除5/6肾脏组织,实验第5周通过检测血清血尿素氮（BUN）判断CKD构建是否成功;non-CKD组小鼠行CKD假手术。实验第5周,对两组小鼠行右侧颈总动脉-颈外静脉侧端吻合术构建AVF,实验第9周收取标本。收集non-CKD组和CKD组小鼠的AVF组织,提取组织蛋白及石蜡包埋切片,免疫印迹蛋白技术检测内瘘组织中YAP表达,HE染色检测内瘘内膜增生程度,免疫组织化学法检测内瘘组织YAP、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达。免疫荧光双重染色法检测内瘘组织炎症细胞标记巨噬细胞表面分子-2（Mac2）和促炎因子白介素-1β（Interleukin-1b,IL-1β）的表达,免疫组织化学法检测内瘘组织促炎因子IL-1β、血清和糖皮质激素调节激酶1（Serum and glucocorticoid-induced kinase 1,SGK1）的表达,荧光定量PCR分析内瘘组织的IL-1β水平。2.血管内皮细胞Yap/Taz基因敲除对内瘘内膜增生的影响Yapf/f/Tazf/f小鼠与VE-cadherin-ERCre+小鼠杂交后回交,得到后代小鼠提取DNA鉴定基因型。选择6只携带3种突变基因的小鼠,用玉米油配制20 mg/ml他莫昔芬溶液,3只小鼠按80 mg/kg剂量进行腹腔注射,另3只小鼠按剂量腹腔注射等体积玉米油作对照,连续5天。收集小鼠动脉进行免疫组织化学染色检测YAP表达,鉴定他莫昔芬诱导特异性Yap/Taz基因敲除效果。选择16只携带3种突变基因的小鼠,按上一部分所述构建CKD模型并检测BUN。实验第3周将16只小鼠随机平均分为血管内皮细胞Yap/Taz基因敲除组（Yap/Taz KO）和对照组（CTL）,Yap/Taz KO组按剂量腹腔注射他莫昔芬玉米油溶液,对照组按剂量注射等体积玉米油,连续5天。实验第5周对16只小鼠行AVF吻合术,第9周收集AVF标本进行石蜡包埋切片。HE染色检测两组小鼠内瘘内膜增生程度,免疫组织化学法检测内瘘组织的增殖标记Ki67、增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-SMA表达。免疫组织化学法检测内瘘组织中炎症细胞标记白细胞共同抗原（Leukocyte common antigen,LCA又称CD45）、Mac2,炎症因子细胞间黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）,促炎因子IL-1β,生长因子结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）的表达。3.Yap/Taz调控血管内皮细胞功能促进血管平滑肌细胞增殖采用磁珠法分离Yapf/f/Tazf/f/VE-cadherin-ERCre+小鼠肺组织中原代EC进行体外培养,经4 u M他莫昔芬处理24小时EC设为特异性Yap/Taz基因敲除EC组（Yap/Taz KO EC）,未处理EC设为对照组（CTL EC）。分别予1 u M溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,LPA）和2 u M 1磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1-phosphate,S1P）刺激两组细胞,24小时后应用免疫蛋白印迹技术检测PCNA的表达,行划痕实验检测细胞迁移能力的变化;免疫蛋白印迹技术检测细胞因子CTGF、SGK1表达。CTL EC、Yap/Taz KO EC分别接种于Transwell板上室,与下室VSMCs共培养,免疫蛋白印迹检测VSMCs的PCNA表达。采用si RNA干扰技术,沉默EC的CTGF表达（si-CTGF EC）,EC CTL、si-CTGF EC分别与VSMCs于6孔板中混合共培养,免疫荧光双重染色观察VSMCs的Ki67表达的变化。100 ng/ml和200 ng/ml CTGF分别刺激VSMCs 24h,免疫蛋白印迹检测PCNA表达;划痕实验检测100 ng/ml CTGF作用下VSMCs迁移能力的变化。研究结果1.YAP蛋白在CKD小鼠内瘘组织中表达增多non-CKD组小鼠AVF建模成功7只（7/8）,CKD组小鼠CKD及AVF建模成功8只（8/12）。免疫蛋白印迹检测内瘘组织YAP表达明显升高,HE染色显示CKD组内瘘管腔面积缩小,免疫组织化学法染色显示内瘘组织YAP、α-SMA表达升高,与non-CKD组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学法染色显示内瘘组织Mac2、IL-1β、SGK1阳性染色比例升高,与non-CKD组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。2.血管内皮细胞Yap/Taz基因敲除减轻内瘘内膜增生免疫组织化学染色结果显示,他莫昔芬处理小鼠动脉内皮层YAP染色呈阴性,对照小鼠内皮层YAP染色呈阳性,证明条件性敲除小鼠血管内皮细胞Yap/Taz基因成功。Yap/Taz KO组小鼠模型构建成功7只（7/8）,CTL组小鼠模型构建成功8只（8/8）。HE染色显示Yap/Taz KO组AVF管腔面积增加,免疫组织化学染色显示内瘘组织α-SMA、PCNA、Ki67阳性染色比例下降,与CTL组对比差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学法染色显示Yap/Taz KO组内瘘组织炎症细胞标记Mac2、CD45、炎症因子ICAM-1、VCAM-1、促炎因子IL-1β、生长因子CTGF阳性染色比例下降,与CTL组对比差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Yap/Taz调控血管内皮细胞功能促进血管平滑肌细胞增殖经S1P、LPA刺激,免疫蛋白印迹结果显示,Yap/Taz KO EC的PCNA、SGK1、CTGF表达降低,与CTL EC相比差异具有统计学意义（P<0.05）,划痕实验中Yap/Taz KO EC迁移率较CTL EC低（P<0.05）。VSMCs分别与Yap/Taz KO EC、CTL EC于Transwell共培养,免疫蛋白印迹结果显示,与Yap/Taz KO EC共培养VSMCs的PCNA表达,比与CTL EC共培养的低（P<0.05）。VSMCs分别与si-CTGF EC、CTL EC混合共培养,免疫荧光双重染色结果显示,相比与CTL EC共培养,与si-CTGF EC共培养的VSMCs增殖能力更低（P<0.05）。VSMCs经CTGF处理,免疫蛋白印迹结果显示处理组PCNA表达较对照组高（P<0.05）;划痕实验中处理组VSMCs迁移率较对照组高（P<0.05）。结论:CKD激活血管内皮细胞YAP/TAZ信号通路,促进AVF内膜炎症细胞浸润,诱导CTGF表达促进血管平滑肌细胞增殖,参与AVF内瘘增生的发生发展。