肝宁方对正常人体肝细胞内质网应激GRP78的调节作用

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内质网系细胞内蛋白质、脂类和糖类的重要合成场所,是细胞内钙离子的储存场所,与物质运输、交换、解毒有密切相关的关系。内质网应激主要是细胞的一种重要自我防御机制,强烈持续的内质网应激最终诱导细胞不可逆的伤害甚至凋亡。而肝脏细胞内富含有许多的内质网,目前研究表明许多肝脏疾病都涉及到内质网应激。  目的:近年来内质网应激被广大学者所关注,发现其余肝脏疾病有着密切的关系。本研究的主要目的是探查GRP78对诱导正常人体肝细胞HL7702发生ERS有何密切的关系。  方法:含药血清的制备:SPF级SD大鼠20只,给予25g/(kg·d),灌胃给药,2次/d,连续给药7天,最后1d禁食24h。末次给足全天药量2h后,麻醉,腹主动脉取血。血液需37℃水浴60min,3000r/min离心15min,然后取上清。56℃水浴30min灭活补体,过滤除菌,-57℃条件下真空干燥48h形成干燥粉末,保存备用。将RPMI-1640培养液中加入含药血清,体积分数为20%(即20mL含药血清加培养液至100mL),正常血清组(含正常大鼠血清为20%)。细胞株:采用人正常肝细胞株HL-7702。内质网应激模型的建立:细胞正常培养72h后,加入0.10ug/mL衣霉素培养基培养48h。分组与给药:将细胞分成3组,分别为正常对照组,内质网应激模型组,肝宁方治疗组。将重悬于RPMI-1640含药完全培养基的细胞,每组5个复孔,每孔加1mL细胞悬液,加入含药血清培养液1mL,浓度为10ug/mL,培养72h后分离细胞。细胞培养爬片,以抗GRP78为一抗进行标记,4℃过夜孵育,用FITC标记的二抗进行追踪标记,避光孵育2h,漂洗,甘油封片,在激光共聚焦显微镜下观察GRP78在内质网及胞浆中的分布情况。RT-PCR检测GRP78mRNA。Western blot检测GRP78蛋白表达。  结果:激光共聚焦显微镜下观察到的GRP78密度,随着依霉素的增高而增高。Western blot结果显示正常组、模型组、治疗组内GRP78的表达情况:正常肝细胞中的GRP78的蛋白条带较淡,而模型组细胞中GRP78蛋白条带较亮,治疗组细胞中的GRP78蛋白条带也较淡。与正常组相比,模型组内的GRP78表达量明显提高(P<0.05)而与治疗组内的GRP78表达相比,模型组比治疗组的表达含量明显提高(P<0.05),而正常组与治疗组表达含量没有太大区别(P>0.05)。并且随着浓度的增加条带的颜色也加深。RT-PCR检测结果:与正常肝细胞细胞相比,0.3ug/ml、0.5ug/ml模型组中的GRP78的表达水平显著上升,与正常组相比有显著差别(P<0.05),治疗后GRP78的表达水平显著下降,与正常组表达无明显区别(P>0.05)。1ug/ml模型组中的GRP78的表达水平显著上升,与正常组相比有显著差别(P<0.05),治疗后GRP78的表达水平显著下降,与模型组有显著差别(P<0.05),但与正常组表达有显著区别(P<0.05)。  结论:(1)衣霉素诱导正常人体肝细胞内质网应激(ERS)模型成功。(2)随着衣霉素浓度的增加调节蛋白的表达也增加,两者成正相关。(3)肝宁方含药血清对ERS细胞干预后,GRP78的表达变化说明了肝宁方含药血清对ERS细胞模型有治疗作用。
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