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本文着重探讨了在爪蟾卵母细胞分裂过程中PAK2是否参与胞质分裂和极体形成及与Cdc42的关系。
实验材料：
1、PAK2、Cdc42相关质粒及分子生物学试剂。
2、蛋白质免疫印迹检测试剂。
3、荧光标记的相关分子生物学试剂。
实验方法：
一、爪蟾卯母细胞的准备及裂解
爪蟾皮下注射孕马血清促性腺激素(serum gonadotrophin，PMSG)50IU，3日后处死爪蟾，取卵巢组织，在显微镜下将其分离为15个卵左右的碎片。用胶原酶(1mg/mL)消化卵母细胞3h，取大小相似、发育成熟Ⅵ期卵母细胞，置于1×OR2(无Ca<2+>)培养液(83 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1mmol/L MgCl<,2>，1 mmol/LNa<,2>HPO<,4>，5 mmol/L HEPES pH 7.8)中，室温震荡培养4h。10μL冷裂解缓冲液(EB缓冲液：20mM pH 7.3 HEPES，80mmol/L磷酸甘油，20mmol/L EGTA，15mmol/LMgCl<,2>，1mmol/L二硫苏糖醇，10μmol/L ATP，150mmol/L NaF，10μg/mL抑(蛋白)酶醛肽，200μmol/L苯甲磺酰氟，25μg/mL苯甲脒)裂解卵母细胞，4℃13，000g离心5min，上清液与2xSDS样品缓冲液、β-巯基乙醇混合，．20℃贮存。
二、爪蟾卵母细胞成熟过程中PAK2磷酸化状态观察
抗p-PAK2(Thr402)蛋白质印迹检测：孕酮刺激后不同时间点(0h、1h、2h、3h、3.5h)以及胚泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)发生后不同时间点(0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、12h)的爪蟾卵母细胞裂解液在15％SDS．PAGE电泳中分离，电转移至硝酸纤维素膜，10％BSA封闭1h；与抗p-PAK2抗体9呼育2h，相应的二抗孵育1h，ECL发光法检测。
三、体外合成PAK2-NT、PAK2-NTm、GFP-wGBD mRNA
将PCS2-HA-PAK2-NT(PCS2-HA-PAK2-N-terminal)、PCS2-HA-PAK2-NTm(PCS2-HA-PAK2-N-terminal mutation)、GFP-wGBD质粒用特异性限制性内切酶进行酶切线性化，1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以线性化DNA为模板、合成PAK2-NT、PAK2-NTm、GFP-wGBD mRNA，-70℃保存备用。
四、荧光显微镜观察爪蟾卵母细胞DNA染色
观察对照组、PAK2-NT mRNA注射组和PAK2-NTm mRNA注射组爪蟾卵母细胞GVBD发生情况；按GVBD发生时间，收集单个卵母细胞，转移到新鲜配置的1×OR2培养液中。GVBD发生后70min，将卵母细胞放置在含有Hoechst染料(1：5000)的溶液中，染色10min后，荧光显微镜延迟摄影法(time-lapse)观察三组卵母细胞染色体的变化。
五、共聚焦显微镜观察爪蟾卵母细胞胞质分裂过程
15nL Alexa-488-phalloidin(4U/ml)和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同显微注射PAK2-NT mRNA、PAK2-NTm mRNA注射组及无注射对照组爪蟾卵母细胞。室温孵育过夜，翌日1μmol/L孕酮溶液刺激卵母细胞，利用共聚焦显微镜观察两组卵母细胞的形态变化，time-lapse方法观察。用20nL 0.25mg/ml GFP-wGBD mRNA和10nL Rhodamine-tubulin(3mg/ml)共同注射入对照组、PAK2-NT mRNA和PAK2-NTm mRNA注射组的爪蟾卵母细胞，室温孵育过夜，翌日1μmol/L孕酮溶液刺激卵母细胞。利用共聚焦显微镜观察三组卵母细胞的形态变化，time-lapse方法观察。
六、统计学分析
比较正常爪蟾卵母细胞、PAK2-NT mRNA注射组、PAK2-NTm mRNA注射组的爪蟾卵母细胞极体形成百分率，采用SPSSl 1.5统计学软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学意义。
实验结果：
一、爪蟾卵母细胞成熟过程中PAK2磷酸化状态观察
利用p-PAK2(Thr402)抗体检测爪蟾卵母细胞成熟过程中内源性PAK2磷酸化活性变化。结果表明GV期PAK2处于无活性状态，在卵母细胞GVBD发生后，PAK2处于磷酸化活性状态，并且在卵母细胞成熟过程中保持活性。
PAK2-NT mRNA注射组，GV期未见PAK2磷酸化，GVBD发生后PAK2呈现弱磷酸化状态，12h后未见PAK2磷酸化。用抗HA-tag抗体检测显微注射PAK2-NT mRNA的卵母细胞是否表达PAK2-NT融合蛋白，结果显示，PAK2-NTmRNA注射组，GV和GVBD发生后均有PAK2-NT蛋白表达，而对照组无，说明显微注射PAK2-NT mRNA的卵母细胞表达PAK2-NT。
二、荧光显微镜观察爪蟾卵母细胞DNA染色结果
爪蟾卵母细胞GVBD 70min后Hoechst DNA染色结果：对照组卵母细胞，正常胞质分裂并且形成极体；PAK2-NT mRNA和PAK2-NTm mRNA注射组爪蟾卵母细胞染色体完成复制，未见极体形成。
三、PAK2-NT、PAK2-NTm抑制爪蟾卵母细胞胞质分裂
Alexa-488-phalloidin和Rhodamine-tubulin共同注射三组爪蟾卵母细胞，time-lapse实时观察发现：对照组卵母细胞中，F-肌动蛋白聚集并环绕于纺锤体上方和周边，形成收缩环，收缩环向内切断纺锤体，形成极体；PAK2-NT mRNA注射组和PAK2-NTm mRNA注射组未见F-肌动蛋白聚集，收缩环和极体形成，可见纺锤体逐渐拉长，最终未完成胞质分裂。
四、共聚焦显微镜观察爪蟾卵母细胞胞质分裂过程中Cdc42活性变化
GFP-wGBD探针可观察爪蟾卵母细胞内Cdc42活性变化。对照组卵母细胞，GV和GVBD发生后，未观察到Cdc42活性变化。在极体释放数分钟前，纺锤体上方可见微弱的Cdc42活性，活性逐渐增强，随后收缩环形成，胞质分裂发生。Cdc42活性向下扩展，包绕整个极体；PAK2-NT：mRNA注射组未见明显的Cdc42活性变化，但可见纺锤体发生与对照组相似的变化，最终未形成极体；PAK2-NTmmRNA注射组可见Cdc42的活性出现在纺锤体上方，持续数分钟，但是没有形成收缩环，未见极体形成。
五、统计学分析
采用SPSSl1.5统计学软件进行统计分析，正常对照组爪蟾卵母细胞、PAK2-NT mRNA注射组、PAK2-NTm mRNA注射组的爪蟾卵母细胞极体形成百分率的差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组卵母细胞相比，PAK2-NTmRNA注射组、PAK2-NTm mRNA注射组的卵母细胞极体形成百分率明显降低。
实验结论：
1、爪蟾卵母细胞GV期PAK2处于无活性状态，在卵母细胞GVBD发生后，PAK2处于磷酸化活性状态，并且在卵母细胞成熟过程中保持活性。
2、注射了PAK2-NTmRNA和PAK2-NTm mRNA的爪蟾卵母细胞GV和GVBD未见明显形态学变化，孕酮诱导的GVBD也未见明显异常。
3、PAK2-NTmRNA和PAK2-NTm mRNA注射组的爪蟾卵母细胞胞质分裂和极体形成障碍。
4、在爪蟾卵母细胞中，PAK2参与胞质分裂和极体形成可能是不依赖于Cdc42活性。