论文部分内容阅读
AGL1基因属于MADS-box基因家族，MADS-box基因家族在植物花发育等许多方面起着重要的作用。因此，对于大豆来说，克隆大豆胚珠特异性表达的启动子AGL1对研究大豆花发育的分子调控机制及分子育种具有重要的理论和实际意义。
本文以“小黄豆”品种为材料，通过拟南芥CDS确定大豆的CDS，然后根据查找到的AGL1启动子和内含子序列设计引物，进行PCR扩增。将获得的特异性序列连接到T载体，并进行酶切鉴定，将鉴定得到的反向连接的启动子序列和正向、反向连接的内含子序列进行测序。测序结果显示，通过TA克隆法从大豆中克隆了约1568bp的大豆胚珠特异性表达的AGL1启动子和3968bp的AGL1内含子与网上公布的序列同源性是99％，说明所克隆的序列克隆成功。
将通过TA克隆的反向AGL1启动子序列用EcoR(I)和Pst(I)进行双酶切，同时对pCAMBIA1391Z载体也进行EcoR(I)和Pst(I)双酶切，然后把双酶切后的反向AGL1启动子序列和双酶切后的pCAMBIA1391Z载体进行连接，命名为pBIA1391ZAGL1P。将反向AGL1内含子序列和经EcoR(I)和Nco(I)双酶切后的pBIA1391ZAGL1P进行连接，命名为pBIA1391ZAGL1PI。另外，内含子对启动子可能有调控作用，将通过TA克隆获得的正反向内含子序列和-49+pBIA1391Z载体进行EcoR(I)和Nco(I)双酶切后连接，并命名为pBI1391Z+（-49）-AGLI（正义连接）和pBI1391Z+(-49)-AGLI（反义连接）。经酶切鉴定，上述植物表达载体均构建正确。
表达载体构建成功后，通过冻融法将植物表达载体pBIA1391ZAGL1P，pBIA1391ZAGL1PI转入农杆菌EHA105中。通过叶盘法将含有pBIA1391ZAGL1P和pBIA1391ZAGL1PI载体的农杆菌EHA105侵染烟草无菌苗叶片，并且经潮霉素筛选，获得再生的抗性植株35棵，并对抗性植株进行PCR分析，获得转基因植株35棵。对大豆根、茎、叶及花的不同时期不同部位进行RT-PCR，分析得出大豆根、茎、叶没有表达。通过对抗性植株GUS染色进行表达分析，其中35棵抗性植株中有3棵被染色。