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目的:信号转导和转录激活因子1(STAT1)是STAT家族中第一个被发现的转录因子,参与IFN的信号转导过程,为先天性免疫所必需。IFN-γ等细胞因子通过JAK-STAT途径激活STAT1而诱导目的基因表达,参与细胞因子介导的信号转导过程,导致气道的炎症和高反应性,而支气管哮喘气道炎症常与气道上皮细胞STAT1途径的信号传导异常有关。本研究通过设计针对STAT1的发夹样RNA干扰重组体,用脂质体转染IFN-γ刺激后的人气道上皮细胞(16HBE),研究其对16HBE细胞中STAT1蛋白表达的影响,检测其干扰活性,为探讨支气管哮喘等炎症性疾病的基因治疗奠定基础。方法:本研究分两部分进行:1. STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,最后选择两条片段作为STAT1基因干扰片段;另设计一条由任一个片段随机重排而成的阴性对照;再分别转化为能表达其shRNA的互补DNA序列,经退火形成双链,将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,用SacI进行限制性酶切鉴定并做测序分析。构建的重组质粒分别命名为pGSTAT1-1、pGSTAT1-2、和阴性对照pG-HK。2. STAT1特异性siRNA真核表达载体对16HBE细胞中STAT1蛋白表达的影响:采用重组质粒pGSTAT1-1与脂质体以1﹕1～1﹕5的比例分别转染16HBE细胞,并设空白对照组,共六组,在转染后24、48、72h观察细胞形态变化及荧光表达,鉴定其不同条件下的转染效率;分四个组用IFN-γ刺激16HBE细胞,分别在刺激后0min、30min、12h、24h提细胞总蛋白,采用Western blotting技术检测IFN-γ刺激后细胞中STAT1蛋白的相对含量;选用pGSTAT1-1质量与脂质体体积为1μg : 2μl的条件分四个组转染IFN-γ刺激30min的16HBE细胞,分别为:空质粒组、pGSTAT1-1组、pGSTAT1-2组、和阴性对照pG-HK组,在转染后48h提取细胞总蛋白,用Western blotting技术检测每组中STAT1蛋白的相对含量,以鉴定RNA干扰重组体的活性。实验数据采用SPSS13.0软件作统计学处理,进行单因素方差分析和随机区组设计的方差分析,多个样本均数之间的多重比较用LSD法,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:通过酶切鉴定和测序,证实两个STAT1靶向RNA干扰重组体pGSTAT1-1、pGSTAT1-2、及一个阴性对照pG-HK连接正确,并成功转染到16HBE细胞中。采用pGSTAT1-1与脂质体以不同比例转染16HBE细胞,在转染后48h以1﹕2转染组转染效率最高,达58.21%(P<0.01),通过Western blotting检测:发现IFN-γ刺激后30min组STAT1蛋白相对含量明显高于刺激24h组(P=0.01), IFN-γ刺激30min组与刺激12h组细胞STAT1蛋白表达比较无统计学意义(P=0.531),IFN-γ刺激后0min组与其余三组细胞STAT1蛋白表达差异有统计学意义(P=0.000)。重组干扰质粒转染IFN-γ刺激30min的16HBE细胞,能降低细胞STAT1蛋白表达水平,转染后48h,pGSTAT1-2抑制率达57.62%,STAT1蛋白相对含量明显低于空质粒组和pG-HK组(P =0.01),同时也明显低于pGSTAT1-1组(P=0.04);pGSTAT1-1抑制率达30.64%,STAT1蛋白相对含量明显低于空质粒组和pG-HK组(P<0.05),而空质粒组与pG-HK组比较差异无统计学意义(P=0.713)。结论:1. STAT1靶向RNA干扰重组体pGSTAT1-1,pGSTAT1-2成功构建,并能够高效转染到16HBE细胞。2. IFN-γ刺激16HBE细胞后能够增加该细胞中STAT1蛋白的表达,且在30min达高峰并能持续至24h。3. STAT1特异性siRNA真核表达载体可抑制16HBE细胞中STAT1蛋白的表达,而靶位点的选择不同至所构建的质粒干扰活性不同。4.以STAT1为靶点的RNA干扰技术可望成为哮喘等气道炎症性疾病基因治疗的新方法。