引言:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性、以炎性滑膜炎为主要表现的系统性疾病,其病因至今尚未真正明确。目前,临床上用于治疗RA的药物大致分为三类即改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs）、甾体抗炎药（steroidal anti-inflammatory drugs,SAIDs）和非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）,这些药物在一定程度上可以对RA的病情有所缓解,然而长期使用后会导致胃肠道反应、肝肾损害等不良反应的发生。近些年随着人们对炎症免疫通路的深入研究,一些用于治疗RA的新型药物如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抑制剂、T细胞抑制剂、细胞因子单抗等被陆续投入使用,这些新型药物可以靶向性得治疗RA,在一定程度上减少不良反应的发生,但长期使用也可引起如神经系统毒性等较严重的不良反应。1965年,免疫球蛋白D（Immunoglobulin D,IgD）被首次发现,IgD单体的组成部分包括两条相同的轻链和重链,分为分泌型IgD（secreted IgD,s IgD）和膜结合型IgD（membrane IgD,m IgD）。s IgD的水平被认为是IgD多发性骨髓瘤的重要指标,多项研究表明s IgD在多种疾病中发挥着确切的作用:在患有免疫缺陷、慢性感染、过敏性疾病、自身免疫性疾病和遗传性综合征的患者血清中,s IgD是异常高表达的。s IgD功能的发挥必须通过其与膜受体即IgD受体（IgD receptor,IgDR）结合才能实现,人类外周血T细胞和非T细胞上以及小鼠T细胞上均发现有IgDR的存在,但至今它的基因序列与具体结构仍然未知。抗原特异性T细胞克隆增加是由IgD与T细胞上IgDR相互作用所诱导的,同时发现了抑制T细胞凋亡可以通过B细胞上m IgD与T细胞上IgDR交联而得以实现,提示IgDR在双向调节T-B细胞相互作用的过程中发挥着重要的作用,IgDR不仅活化T细胞还能促进B细胞产生抗体。课题组前期工作发现与健康对照者相比,RA患者外周血中s IgD和m IgD是异常高表达的,s IgD体外刺激能增加RA患者外周血中活化T细胞的百分比。IgD体外诱导健康对照者CD4⁺T细胞的异常活化和T细胞亚群Th1/Th2、Th17/调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）比例失衡的同时促进了淋巴细胞特异性酪氨酸激酶（lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase,Lck）的磷酸化,提示IgD诱导IgDR的表达可能与一个或几个酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）激活通路的激活有关。其中涉及的蛋白可能包括Src家族的Lck,Zeta相关蛋白70（zeta-chain associated protein kinase,ZAP70）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）。综合以上内容提示我们,RA患者T、B细胞的异常活化可能与IgD-IgDR的作用密切相关,IgD-IgDR可能成为治疗RA的新靶点,但其具体分子机制不清楚,需要进一步研究。为了特异性阻断IgD-IgDR通路,课题组已经成功将人IgD-Fc段与人Ig G₁-Fc段连接并纯化IgD-Fc-Ig融合蛋白,已获得中国发明专利（201510600762X）。我们提出假设:在RA的发生发展过程中,IgD是否通过T细胞上的IgDR与Lck的直接作用激活下游信号通路（Lck-ZAP70-PI3K）并活化T细胞?活化的T细胞是否进一步通过与B细胞相互作用促进B细胞的活化?IgD-Fc-Ig是否可以通过阻断IgD-IgDR从而影响Lck及下游信号通路抑制T、B细胞的活化?本文以RA患者和健康对照者的CD4⁺T细胞和CD19⁺B细胞为研究对象,采用流式细胞术、细胞共培养、免疫印迹和激光共聚焦等技术,检测IgD通过T细胞IgDR-Lck信号活化B细胞的功能,以及IgD-Fc-Ig融合蛋白的作用;通过小鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）模型的建立,进一步阐述CIA小鼠中IgD诱导的CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞功能的影响以及IgD-Fc-Ig融合蛋白的作用。拟阐明高表达的IgD在RA中的病理作用,也为将IgD-Fc-Ig融合蛋白开发为高选择性治疗RA的创新药物提供实验依据。目的:明确类风湿关节炎中IgD通过IgDR-Lck-ZAP70-PI3K信号通路影响T细胞的活化,从而诱导B细胞活化的作用机制。阐明IgD-Fc-Ig对T、B细胞的影响及其作用机制。方法:收集健康对照者和RA患者的外周血并记录RA患者DAS28评分及临床生化指标检测结果,ELISA法检测健康对照者和RA患者的血浆IgD水平;分析RA患者的血浆IgD水平与生化指标、DAS28评分的相关性;通过密度梯度离心法得到健康对照者和RA患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,利用流式分选收集从PBMCs中分选出的CD4⁺T细胞和CD19⁺B细胞;激光共聚焦和免疫共沉淀法检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者CD4⁺T细胞上IgDR和Lck信号共表达的影响;Western blot检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者CD4⁺T细胞上p-Lck、ZAP-70、p-ZAP70、PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响;CCK-8法检测健康对照者和RA患者中IgD刺激的CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞活力的影响;Western blot检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的人CD4⁺T细胞和CD19⁺B细胞上CD40L蛋白和CD40蛋白表达的影响;流式细胞术检测IgD诱导RA患者CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞上共表达分子CD86表达的影响及IgD-Fc-Ig的作用;建立CIA小鼠模型,DBA/1小鼠被随机分为9组,即正常组、模型组、IgD-Fc-Ig四个剂量组（1.625、3.25、6.5、13mg/kg）、阳性对照组依那西普（rh TNFR:Fc,4.5mg/kg）和抗IgD抗体（2mg/kg）,Ig G₁-Fc（13mg/kg）被设为阴性对照组,每组10只。ELISA检测正常小鼠和CIA小鼠的血浆中IgD水平;免疫组化法检测IgD-Fc-Ig对小鼠脾脏组织中IgD、CD40L和CD40蛋白表达的影响;Western blot检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的小鼠CD4⁺T细胞上CD40L蛋白和CD19⁺B细胞上CD40蛋白表达的影响;ELISA检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的小鼠CD4⁺T细胞上清中细胞因子IL-17水平的影响。结果:1. RA患者的血浆IgD水平与生化指标、DAS28评分的相关性收集30名RA患者,女性患者24名,男性患者6名,年龄29～73岁,抗环瓜氨酸多肽（Anti-cyclic citrullinated peptide,Anti-CCP,RU/ml）的临床正常范围为0～25,30名RA患者Anti-CCP的数值均超出正常范围;RA患者的血浆IgD水平显著高于健康对照者（105.8mg/L±7.7 vs.7.09mg/L±0.48）;设定IgD血浆浓度高于80mg/L为IgD高表达的人群,30名RA患者中有16名RA患者高表达IgD;且RA患者的血浆IgD水平与Anti-CCP水平、DAS28评分具有显著相关性。2. IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者CD4⁺T细胞IgDR和Lck共表达的影响免疫共沉淀和激光共聚焦的结果显示,正常情况下,IgDR和Lck信号在CD4⁺T细胞存在共表达,IgD（3μg/ml）体外刺激健康对照者PBMCs中的CD4⁺T细胞24h后可上调IgDR与Lck的共表达;IgD-Fc-Ig（10μg/ml）与阳性对照药Lck抑制剂A770041（10μg/ml）均可抑制IgD上调IgDR和Lck信号在CD4⁺T细胞上的共表达。3. IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者CD4⁺T细胞上p-Lck、ZAP-70、p-ZAP70、PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响IgD（3、10μg/ml）体外刺激健康对照者PBMCs中的CD4⁺T细胞24h后可显著上调p-Lck、p-ZAP70、p-PI3K蛋白在CD4⁺T细胞上的表达;IgD-Fc-Ig（10μg/ml）与阳性对照药Lck抑制剂A770041（10μg/ml）均可抑制IgD对三种蛋白在CD4⁺T细胞上的上调作用;各处理组中CD4⁺T细胞上ZAP70和PI3K总蛋白的表达无显著变化。4. IgD刺激的健康对照者CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞增殖的影响IgD（1、3、10μg/ml）体外刺激的健康对照者CD4⁺T细胞与CD19⁺B细胞共培养24、48 h后均可诱导CD19⁺B细胞的增殖。5. IgD对健康对照者CD4⁺T细胞上CD40L蛋白和CD19⁺B细胞上CD40蛋白表达的影响IgD（3、10μg/ml）体外刺激的健康对照者CD4⁺T细胞与CD19⁺B细胞共培养48小时后均可上调CD40L蛋白在CD4⁺T细胞上的表达以及CD40蛋白在CD19⁺B细胞上的表达;6. IgD刺激的RA患者CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞增殖的影响IgD（1、3、10μg/ml）刺激的RA患者CD4⁺T细胞与CD19⁺B细胞共培养24、48 h后均可诱导CD19⁺B细胞的增殖。7. IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者CD4⁺T细胞上CD40L蛋白和CD19⁺B细胞上CD40蛋白表达的影响IgD（3、10μg/ml）体外刺激的RA患者CD4⁺T细胞与CD19⁺B细胞共培养48小时后均可上调CD40L蛋白在CD4⁺T细胞上的表达以及CD40蛋白在CD19⁺B细胞上的表达;IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）均可抑制IgD上调CD40L蛋白在CD4⁺T细胞上以及CD40蛋白在CD19⁺B细胞上的表达。8. IgD-Fc-Ig对IgD诱导的RA患者CD4⁺T细胞对CD19⁺B细胞上CD86蛋白表达的影响IgD（10μg/ml）体外刺激的RA患者CD4⁺T细胞与CD19⁺B细胞共培养48小时后可上调共刺激分子CD86在CD19⁺B细胞上的表达;IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）均可抑制IgD上调共刺激分子CD86在CD19⁺B细胞上的表达。9. 正常小鼠和CIA小鼠的血浆IgD水平与正常组小鼠相比,CIA小鼠血浆IgD水平显著高于正常组（50.19mg/L±15.58 vs.25.58 mg/L±7.31）。1 0. IgD-Fc-Ig对小鼠脾脏组织中IgD、CD40L和CD40蛋白表达的影响模型组小鼠脾脏中IgD、CD40L和CD40蛋白的表达要明显高于正常组;阳性对照药依那西普（4.5mg/kg）和抗IgD抗体（2mg/kg）可下调IgD、CD40L和CD40蛋白在小鼠脾脏中的表达;同时,IgD-Fc-Ig三个剂量组（3.25、6.5、13 mg/kg）可浓度依赖性下调IgD、CD40L和CD40蛋白在小鼠脾脏中的表达,阴性对照组Ig G₁-Fc（13mg/kg）对蛋白的表达无明显作用。11.IgD-Fc-Ig对IgD诱导CIA小鼠CD4⁺T细胞上CD40L蛋白和CD19⁺B细胞上CD40蛋白表达的影响体外IgD（3μg/ml）刺激CIA小鼠脾脏中的CD4⁺T细胞,与CD19⁺B细胞共培养48小时后均可上调CD40L蛋白在CD4⁺T细胞上的表达以及CD40蛋白在CD19⁺B细胞上的表达;IgD-Fc-Ig（10μg/ml）与阳性对照药Lck抑制剂A770041（10μg/ml）均可抑制IgD上调CD40L蛋白在CD4⁺T细胞上以及CD40蛋白在CD19⁺B细胞上的表达,阴性对照组Ig G₁-Fc段蛋白无明显作用。12.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的小鼠T细胞上清中IL-17水平的影响体外IgD（3μg/ml）刺激CIA小鼠脾脏中的CD4⁺T细胞,与CD19⁺B细胞共培养48h后可上调CD4⁺T细胞的细胞上清中细胞因子IL-17的水平;IgD-Fc-Ig（3、1 0 μg/ml）与阳性对照药Lck抑制剂A770041（1 0 μg/ml）均可抑制IgD上调IL-17的表达,阴性对照组Ig G₁-Fc段蛋白无明显作用。结论:1.IgD可通过影响T细胞IgDR-Lck-ZAP70-PI3K信号通路诱导T细胞的活化。2.IgD活化的T细胞与B细胞共培养后,使得CD40-CD40L共刺激分子的表达增多,诱导B细胞的活化。3.IgD-Fc-Ig融合蛋白抑制T、B细胞的活化的作用机制与其阻断T细胞IgD-IgDR-Lck-ZAP70-PI3K信号通路有关。