雷公藤红素通过Wnt/β-catenin信号通路调控膀胱癌细胞的生物学活性

来源 :郑州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gz20090907
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目的:本实验以人膀胱癌T24细胞为研究对象,予以不同浓度的雷公藤红素共培养,观察其对T24细胞增殖、凋亡、转移和侵袭活性的影响,同时检测其对细胞内Wnt/β-环连蛋白(β-catenin)信号通路相关因子表达的影响,探讨其影响T24细胞生物学活性的作用机制。方法:将不同浓度雷公藤红素(0μM、1 μM、2 μM、4 μM)与人膀胱癌T24细胞共培养24 h、48 h和72 h后,MTT法检测雷公藤红素对细胞增殖活性的影响;将不同浓度雷公藤红素(0 μM、1 μM、2μM、4μM)与人膀胱癌T24细胞共培养24 h后,Annexin V-FITC/PI联合流式细胞仪检测雷公藤红素对细胞凋亡的影响,细胞划痕实验检测雷公藤红素对细胞迁移能力的影响,Transwell小室实验检测雷公藤红素对细胞侵袭能力的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测雷公藤红素对T24细胞内Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-环连蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和蓬乱蛋白(Dishebelledl,Dvl)蛋白表达,Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因中能促进癌细胞增殖的因子原癌基因(c-myc)和细胞周期蛋白D1(cyclin Dl)的蛋白表达,能抑制癌细胞凋亡的因子生存蛋白(Survivin)的蛋白表达,间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein,MMP-9)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-Smooth Muscle Actin,α-SMA)蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测上皮细胞标志物钙粘附蛋白-E(E-cadherin)和紧密连接蛋白-1(Zona occluden-1,Zo-1)mRNA 表达。结果:1.将不同浓度雷公藤红素(0 μM、1μM、2μM、4 μM)与人膀胱癌T24细胞共培养24 h、48 h和72 h后,细胞增值率随着药物浓度的增加而降低,差异具有统计学意义(F(24 h)=4.361,P=0.031;F(48 h)=10.821,P=0.014;F(72 h)=11.356,P=0.000),提示雷公藤红素能抑制T24细胞的增殖活性,且这种抑制作用随着药物剂量的增加而增加。2.不同浓度雷公藤红素(0 μM、1 μM、2μM、4μM)与T24细胞共培养24 h 后,细胞凋亡率分别为(4.6±0.67)%、(15.8±1.7)%、(26.3±2.66)%和(41.73±3.04)%,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率随之增加,差异有统计学意义(F=6.410,P=0.000)。提示雷公藤红素能促进T24细胞的凋亡,且这种抑制作用在一定范围内呈剂量依赖性。3.不同浓度的雷公藤红素与细胞共培养24 h后,OμM、1 μM、2μM和4 μM组细胞 24 h 的细胞迁移率分别为(93.90±5.84)%、(67.26±6.10)%、(38.22±4.20)%和(19.88±2.31)%,各药物浓度组间细胞迁移率间具有统计学意义(F=9.510,P<0.001)。提示雷公藤红素能抑制人膀胱癌T24细胞的迁移能力,且这种抑制作用具有剂量依赖性。4.不同浓度的雷公藤红素与细胞共培养24 h后,0μM、1μM、2μM和4μM组细胞24 h后透过小室基底膜细胞数量分别为(842.3±52.27)、(704.2±47.10)、(504.3±32.78)和(207.3±28.01)个,各药物浓度组间细胞数量具有统计学意义(F=11.256,P<0.001)。提示雷公藤红素能抑制人膀胱癌T24细胞的侵袭能力,且这种抑制作用具有剂量依赖性。5.不同浓度的雷公藤红素(0μM、1 μM、2μM、4 μM)与细胞共培养24h后,人膀胱癌T24细胞内β-catenin蛋白表达分别为0.92±0.12、0.78±0.09、0.42±0.05和0.26±0.03,随着药物浓度的增加,β-catenin蛋白表达随之下降,组间差异有统计学意义(F=12.410,P<0.001);GSK-3β蛋白表达量分别为0.31±0.06、0.56±0.12、0.89±0.13和1.06±0.21,随着药物浓度的增加,GSK-3β蛋白表达随之增加,组间差异有统计学意义(F=9.642,P<0.001);Dvl蛋白表达量分别为1.15±0.31、0.90±0.10、0.73±0.07 和 0.48±0.05,随着药物浓度的增加,Dvl 蛋白表达随之降低,组间差异有统计学意义(F=9.642,P<0.001)。提示雷公藤红素对人膀胱癌T24细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性可能存在抑制作用。6.不同浓度的雷公藤红素(0μM、1 μM、2 μM、4μM)与细胞共培养24h后,细胞内 E-cadherinmRNA 表达量分别为 0.07±0.01、0.25±0.06、0.47±0.07 和0.78±0.10,组间差异有统计学意义(F=11.513,P<0.001);Zo-1 mRNA表达量分别为0.10±0.02、0.45±0.07、0.56±0.09和0.88±0.12,组间差异有统计学意义(F=10.315,P<0.001),即随着药物浓度的增加,人膀胱癌T24细胞内上皮细胞标志物表达随之增加。7.不同浓度的雷公藤红素(0 μM、1μM、2 μM、4μM)与细胞共培养24h后,细胞内 Vimentin 表达分别为 0.93±0.11、0.81 ±0.06、0.47±0.08 和 0.32±0.05,组间差异有统计学意义(F=5.042,P=0.016);MMP-9表达分别为0.74±0.12、0.65±0.03、0.41±0.04 和 0.28±0.05,组间差异有统计学意义(F=8.972,P<0.001);MMP-9 表达分别为 1.19±0.09、0.82±0.11、0.57±0.08 和 0.26±0.07,组间差异有统计学意义(F=14.351,P<0.001)。提示雷公藤红素对人膀胱癌T24细胞上皮间质化过程有抑制作用。结论:1.雷公藤红素能抑制人膀胱癌T24细胞的增殖活性,促进其凋亡,同时抑制其迁移和侵袭的能力。2.雷公藤红素对人膀胱癌T24细胞生物学功能的调节可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,继而抑制其下游靶基因,如C-myc、Survivin、cyclin D1、E-cadherin、Zo-1、Vimentin、MMP-9 和α-SMA 等表达而实现的。
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