目的:帕金森病(PD)是一种难治性疾病,目前尚无药物能够根治。针灸对PD的治疗作用已经得到大量临床实践证明。近年来对针灸治疗帕金森病的作用机制研究也越来越多,并且分别从实验动物本身、实验方法、观察指标及作用靶点等各个不同角度都做了进一步细化和深入的探索,并取得一定进展。许多证据表明针刺可以通过对多巴胺神经元的影响、抑制细胞凋亡、改善氧化应激、调节免疫异常、抗兴奋毒性作用以及调节线粒体功能紊乱等方面缓解帕金森病症状,干预多巴胺能神经元变性退化,减轻药物副作用。然而,也不难发现,目前的研究作用靶点虽然很广,但是其中各靶点之间的协同作用或相互关系的研究相对较少。本研究在于考察头穴透刺疗法对帕金森病模型小鼠运动神经功能的保护作用,并从线粒体自噬调控线粒体分裂融合的途径探讨头穴透刺疗法对帕金森模型小鼠影响的作用机制。方法:1.MPTP致帕金森病小鼠模型探讨C57BL/6小鼠腹腔注射30 mg/kg 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP),连续5天,建立PD小鼠模型,分别在造模完成时、造模后第7天和第14天观察行为学指标,然后处死小鼠取脑组织,高效液相色谱法检测纹状体DA含量,免疫组化法检测中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)表达,考察自然恢复对MPTP致PD小鼠模型的影响。2.电针参数筛选依据电针仪的频率、强度、时间三个要素,设定不同参数组合,对PD模型小鼠连续治疗7天,检测行为学指标和观察TH 阳性细胞表达,筛选出适宜的电针治疗参数。3.头穴透刺调节PD模型小鼠的运动神经功能的作用研究建立的PD模型小鼠随机分成模型组、电针组和阳性对照组,另设正常对照组。正常对照组及模型组不做处理,电针组进行舞蹈震颤区透刺电针治疗15 min/(次·d),阳性药组灌胃给予美多巴112.5 mg/(kg·d)治疗,连续治疗7天后,测定小鼠脑组织线粒体呼吸链复合物、线粒体膜电位、ATP酶、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等,免疫组化法检测TH阳性细胞数,透射电镜观察脑组织线粒体等的超微结构,Western-Blot检测脑组织中α-突触核蛋白(α-Syn)。4.头穴透刺治疗PD小鼠模型作用机制探讨Western-Blot检测线粒体动力学相关蛋白(Mfn2、Fisl、Drpl)及自噬相关蛋白(Beclinl、LC3I/Ⅱ、P62)的表达。建立的PD模型小鼠随机分成模型组、雷帕霉素组、雷帕霉素+电针组、3-MA组和3-MA+电针组,另设正常对照组。正常对照组及模型组不做处理,雷帕霉素组与雷帕霉素+电针组进行侧脑室注射给药自噬诱导剂雷帕霉素(Rap),3-MA组与3-MA+电针组进行侧脑室注射给药自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA),24h后,电针组、雷帕霉素+电针组及3-MA+电针组开始电针治疗,15 min/(次·d),持续治疗7天后,测定小鼠脑组织线粒体呼吸链复合物、线粒体膜电位、ATP酶和活性氧生成等指标,免疫组化检测TH表达,透射电镜观察脑组织线粒体和自噬小体等超微结构,并检测脑组织中α-突触核蛋白、线粒体动力学相关蛋白(Mfn2、Fisl、Drpl)、自噬相关蛋白(Beclinl、P62、LC3Ⅱ)及自噬上游通路蛋白(AMPK、AKT、MAPK)的表达。结果:1.MPTP诱导稳定的PD小鼠模型采用MPTP持续腹腔注射5天复制PD模型,模型复制完成后,模型小鼠出现体重减轻、行动缓慢、震颤等表现,行为学结果显示爬杆时间延长,2 min内转棒掉落时间缩短、掉落次数增加,而小鼠脑组织中DA含量结果显示其减少80%,TH表达减少约60%(P<0.01),表明MPTP复制PD模型成功。当模型复制完成后第14天,实验结果显示动物体内DA含量及TH阳性细胞的表达逐渐回升,与空白组比较,小鼠纹状体DA含量减少60%,中脑TH减少50%(P<0.05),即DA和TH虽然略有回升,但仍低于正常水平的50%以下,说明MPTP诱导的PD模型小鼠在实验期间14天内可维持稳定状态。2.筛选出适宜的电针治疗参数实验筛选不同电针参数,结果显示在电针参数为2 Hz,连续波,0.2 mA治疗下,PD模型小鼠的运动功能及TH阳性细胞表达水平改善最为明显。因此后续实验选用2 Hz,连续波,0.2 mA作为PD模型小鼠头穴透刺的电针治疗参数。3.头穴透刺调节PD模型小鼠的运动神经功能的作用研究与模型组比较,电针组均能明显缩短爬杆时间,延长2 min内转棒第一次掉落时间和减少掉落次数(P<0.01),提示头穴透刺治疗可有效改善PD小鼠运动功能;电针组能够显著增加模型小鼠TH阳性细胞数(P<0.05),并显著减少α-syn表达(P<0.05),提示头穴透刺有助于促进机体清除脑组织中异常聚集的α-syn,增强TH阳性细胞表达。研究头穴透刺对线粒体功能的影响,结果显示,与空白组相比,模型组线粒体复合物Ⅰ显著降低(P<0.01),线粒体中ROS(Reactive oxygen species)生成显著增加(P<0.01)、而 MDA(Malondialdehyde)含量上升(P<0.01),ATP酶活性显著较少(P<0.05),线粒体膜电位下降(P<0.05),表明MPTP诱导可使小鼠出现线粒体功能障碍;经头穴透刺治疗后,与模型组比较,电针组小鼠脑组织中线粒体复合物Ⅰ活性明显升高(P<0.01),而各组间线粒体复合物Ⅱ～Ⅳ的活性无显著差异;电针组能够显著减少ROS生成(P<0.05)、降低MDA含量(P<0.01),同时升高SOD(Superoxide dismutase)含量(P<0.05),具有升高ATP酶活性趋势,升高线粒体膜电位(P<0.05),说明头穴透刺能有效改善PD小鼠线粒体功能障碍,升高线粒体复合物Ⅰ活性,提高抗氧化应激能力,恢复线粒体膜电位和升高ATP酶活性;透射电镜观察线粒体超微结构结果显示,空白对照组线粒体结构完整,呈长柱型、椭圆形;模型组线粒体外膜破坏,脊结构破坏,外室肿胀,空洞样变性;电针组线粒体外室肿胀情况改善,变性的线粒体明显减少,进一步表明头穴透刺能有效保护PD小鼠线粒体形态,维持其功能。4.头穴透刺治疗PD小鼠模型作用机制探讨通过检测自噬途径相关蛋白和线粒体分裂融合相关蛋白进一步研究其内在分子机理,结果显示,与模型组比较,电针组线粒体分裂蛋白(Drpl,Fisl)表达减少(P<0.05),线粒体融合蛋白(Mfn2)表达增加(P<0.05),提示头穴透刺能够抑制PD模型小鼠线粒体分裂,促进线粒体融合,且电针组Belinl、LC3Ⅱ表达比模型组显著升高(P<0.05),P62表达显著减少(P<0.05),提示头穴透刺可能通过诱导PD模型小鼠发生自噬而发挥改善其运动功能的作用。进一步研究,结合自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA验证头穴透刺是否是通过自噬途径改善PD模型小鼠运动功能障碍。行为学结果显示,与模型组相比,雷帕霉素干预后,可缩短小鼠爬杆时间,延长2 min内转棒第一次掉落时间、减少掉落次数(P<0.01),表明促进自噬可以改善PD小鼠运动功能障碍,而雷帕霉素+电针治疗效果比单独使用雷帕霉素效果更好;而3-MA干预后小鼠爬杆时间明显延长,2 min内转棒第一次掉落时间缩短、掉落次数增加(P<0.01),表明自噬途径受抑制可加重PD小鼠运动功能障碍,而3-MA+电针治疗后,情况明显改善;TH免疫组化结果显示,与模型组相比,雷帕霉素组和雷帕霉素+电针组小鼠TH细胞数显著增加(P<0.01),3-MA组小鼠TH细胞数明显减少(P<0.05);线粒体检测结果显示,与模型组相比,雷帕霉素组和雷帕霉素+电针组小鼠的线粒体复合物Ⅰ活性升高、抗氧化能力升高、膜电位升高、ATP酶活性升高(P<0.05),而3-MA组小鼠线粒体复合物Ⅰ活性降低、抗氧化能力降低、膜电位降低、ATP酶活性降低(P<0.05),3-MA+电针治疗后明显有所改善,提示诱导PD小鼠机体发生自噬对改善其运动功能和线粒体功能具有较好作用。与模型组比较,雷帕霉素和雷帕霉素+电针干预PD模型小鼠后,α-Syn蛋白表达下调(P<0.05),雷帕霉素+电针联用效果优于雷帕霉素单独使用,而3-MA干预PD模型小鼠后,α-Syn蛋白表达上调(P<0.05),3-MA+电针治疗后α-Syn蛋白表达比3-MA组明显下调(P<0.05);提示头穴透刺可促进诱导自噬,有效清除α-Syn蛋白。线粒体分裂融合蛋白检测结果显示,雷帕霉素组和雷帕霉素+电针组线粒体分裂蛋白Drpl和Fisl表达显著减少、融合蛋白Mfn2表达增加(P<0.05),3-MA组小鼠粒体分裂蛋白Drpl和Fisl表达显著增加、融合蛋白Mfn2表达减少、(P<0.05),进一步验证头穴透刺通过诱导PD模型小鼠发生自噬而抑制PD模型小鼠线粒体分裂,促进线粒体融合,从而发挥改善PD小鼠运动功能和线粒体功能的作用。进一步研究头穴透刺对自噬上游启动机制AMPK、AKT和MAPK通路的影响,结果显示,与模型组相比,电针组AMPK蛋白表达下调、p-AMPK蛋白表达上调(P<0.05),AKT及MAPK蛋白无显著改变,提示头穴透刺可能通过干预AMPK信号通路来调控自噬过程的发生与发展,进一步抑制线粒体分裂,促进其融合,维持线粒体形态的完整性,从而发挥改善PD小鼠运动功能和线粒体功能的作用。结论:1、MPTP诱导PD小鼠模型在短期内可稳定表达PD病理特征,模型符合要求,方法简便。2、低电压高电流量的连续波电针治疗对PD模型小鼠神经运动功能改善较为明显。3、头穴透刺对PD模型小鼠神经运动功能改善明显,通过观察诱导及抑制自噬对PD模型小鼠的影响,发现电针可通过诱导自噬,清除α-Syn的聚集,抑制线粒体分裂,促进线粒体融合,改善线粒体功能,从而发挥神经运动功能的保护改善作用。4、经过mTOR上游蛋白通路筛选,发现电针诱导自噬机制与AMPK通路密切相关。