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研究背景与目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在世界范围内胃癌的发病率和病死率分别位列第五和第三。影响胃癌患者生存预后的主要因素是肿瘤的复发和远处转移。因此,探索胃癌发生的潜在分子机制,尤其是转移相关的机制,对降低患者的复发率和死亡率具有重要意义。miR-302c是miR-302家族中的重要成员之一,在多个类型的恶性肿瘤中表达下调,提示其有可能发挥着重要的抑癌作用。多个miRNA相关数据库预测显示,EGFR可能是miR-302c的潜在靶基因。异常表达的EGFR可通过激活PI3K/AKT信号通路诱导上皮间充质转化（EMT）,从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。目前,miR-302c与胃癌的关系尚不清楚。同时,miR-302c与EGFR、PI3K/AKT信号以及EMT之间的调控关系也尚未确立。因此,本课题的研究目的在于探索miR-302c在胃癌中的表达及其临床意义,分析miR-302c对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT的影响,并试图揭示其内在的调控机制,为胃癌的早期诊断和精准化治疗提供新的思路。方法:1.收集2014年9月~2015年11月南昌大学第一附属医院普外科胃癌患者的术后胃癌组织和癌旁组织,q RT-PCT检测miR-302c和EGFR m RNA在上述组织的表达情况,并分析miR-302c与胃癌患者临床病理特征之间的关系。同时,q RT-PCR检测永生化人正常胃粘膜上皮细胞株（GES-1）和胃癌细胞株（MGC-803、MKN-28和SGC-7901）miR-302c的表达情况。2.将胃癌细胞MGC-803分为mimics NC组和miR-302c mimics组,而SGC-7901分为inhibitor NC组和miR-302c inhibitor组。q RT-PCT检测miR-302c和EGFR m RNA在各组细胞的表达水平;CCK-8实验检测各组细胞的增殖能力;划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Western blot检测各组细胞EGFR蛋白以及EMT相关蛋白Vimentin、E-cadherin和Snail的表达水平。3.利用Target Scan、miRDB和micro RNA.org数据库预测miR-302c的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验验证靶基因。胃癌细胞MGC-803分为mimics NC+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRWT组,miR-302c mimics+pmiR-RBReportTM-EGFR-3’UTRWT组,mimics NC+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRMUT组和miR-302c mimics+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRMUT组;而SGC-7901细胞分为inhibitor NC+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRWT组,miR-302c inhibitor+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRWT组,inhibitor NC+pmiR-RB-ReportTMEGFR-3’UTRMUT组和miR-302c inhibitor+pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRMUT组,检测各组细胞的荧光信号强度。4.分别通过生物信息学数据库Human Protein Atlas和Kaplan-Meier Plotter分析EGFR蛋白在胃癌组织的表达以及EGFR和胃癌患者的预后关系。5.将胃癌细胞MGC-803分为Vector组和EGFR组（EGFR过表达）,而SGC-7901分为siRNA NC组和EGFR siRNA组。Western blot检测各组细胞EGFR蛋白的表达水平。6.将胃癌细胞MGC-803分为mimics NC+vector组,miR-302c mimics+vector组和miR-302c mimics+EGFR组,而SGC-7901细胞分为inhibitor NC+siEGFR NC组,miR-302c inhibitor+siEGFR NC和miR-302c inhibitor+siEGFR组。Western blot检测各组细胞的EGFR蛋白、EMT相关蛋白（Vimentin、E-cadherin和Snail）以及PI3K/AKT信号相关蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT）的表达;Transwell试验检测各组细胞的迁移和侵袭能力。结果:1.miR-302c在胃癌组织和胃癌细胞株的表达:q RT-PCT检测结果显示,miR-302c在胃癌组织中的表达量显著低于其在癌旁组织的表达（P<0.01）,3株胃癌细胞（MGC-803、MKN-28和SGC-7901）miR-302c的表达量均显著低于正常胃上皮细胞株GES-1的表达（P<0.05）。2.miR-302c与胃癌患者临床病理特征的相关性:低表达的miR-302c与更高的TNM分期和淋巴结转移显著相关（P<0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小以及分化程度无关（P>0.05）。3.miR-302c mimics和inhibitor转染胃癌细胞的效果验证:q RT-PCT检测结果显示,相比于对照组,MGC-803转染了miR-302c mimics后miR-302c的表达量显著上调（P<0.001）,而SGC-7901转染了miR-302c inhibitor后miR-302c的表达量显著下调（P<0.001）。这些结果表明,miR-302c过表达和敲减的胃癌细胞株构建成功。4.miR-302c对胃癌细胞增殖能力和迁移能力的影响:CCK-8实验和划痕实验结果显示,相比于对照组,转染了miR-302c mimics后MGC-803细胞的增殖和迁移能力显著下降（P<0.05）,而转染了miR-302c inhibitor后SGC-7901细胞的增殖和迁移能力显著增强（P<0.05）。5.miR-302c靶基因的预测及验证:Target Scan、miRDB和micro RNA.org数据库预测结果显示,EGFR可能是miR-302c的潜在靶基因。双荧光素酶报告实验显示,在MGC-803细胞,相比于对照组,miR-302c mimics显著抑制了MGC-803细胞pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRWT的荧光素酶活性（P<0.05）,而不能抑制MGC-803细胞pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRMUT的荧光素酶活性（P>0.05）;而在SGC-7901细胞,相比于对照组,miR-302c inhibitor显著增加了SGC-7901细胞pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRWT的荧光素酶活性（P<0.05）,而不能影响SGC-7901细胞pmiR-RB-ReportTM-EGFR-3’UTRMUT的荧光素酶活性（P>0.05）。这些结果表明,EGFR是miR-302c的直接靶基因,miR-302c可直接靶向作用于EGFR m RNA 3’UTR,作用的位点和预测的结果一致,即EGFR第4574位~4580位的碱基序列。6.miR-302c对胃癌细胞EGFR m RNA和蛋白的调控作用:q RT-PCT和Western blot检测结果显示,相比于对照组,转染了miR-302c mimics后MGC-803细胞的EGFR m RNA和蛋白水平均显著下降（P<0.01）,而转染了miR-302c inhibitor后SGC-7901细胞的EGFR m RNA和蛋白水平均显著上调（P<0.01）。这表明,miR-302c在转录后水平负调控EGFR的表达。7.EGFR在胃癌组织和正常胃组织的表达及其预后价值:q RT-PCT检测结果显示,EGFR在胃癌组织中的表达量显著高于其在癌旁组织的表达（P<0.01）。Human Protein Atlas数据库提供的免疫组化结果显示,胃癌组织中EGFR蛋白的表达量高于正常胃组织,EGFR阳性的着色在胃癌组织中主要位于细胞膜和细胞浆,但在正常胃组织中主要位于细胞膜,这表明胃癌组织中EGFR的亚细胞定位也发生了改变。Kaplan-Meier Plotter数据库结果显示,EGFR高表达组胃癌患者的10年累积生存率显著低于低表达组患者（HR=1.35,95%CI:1.08-1.7,P=0.0092）,EGFR高表达组的中位生存时间为35.2个月,而低表达组为70.2个月。这些结果表明,EGFR在胃癌组织表达上调,并且和胃癌患者的生存预后相关。8.miR-302c对胃癌细胞EMT相关蛋白的的调控作用:Western blot检测结果显示,相比于对照组,转染了miR-302c mimics后MGC-803细胞的Vimentin蛋白和Snail蛋白表达显著下调,而E-cadherin表达量明显增加（P<0.05）;而转染了miR-302c inhibitor后SGC-7901细胞EMT相关蛋白的表达相反。这表明,miR-302c抑制了胃癌细胞的EMT。9.EGFR过表达质粒和EGFR siRNA的转染效果验证:Western blot结果显示,相比于对照组,转染了EGFR过表达质粒后MGC-803细胞EGFR表达量显著增加（P<0.01）,而转染EGFR siRNA后SGC-7901细胞的EGFR表达量显著下调（P<0.01）。这些结果表明,EGFR过表达和敲减的胃癌细胞株构建成功。10.miR-302c通过靶基因EGFR调控EMT:Western blot结果显示,和对照组相比,在miR-302c mimics组,MGC-803细胞的Vimentin和Snail蛋白的表达均显著下降,而E-cadherin蛋白表达上调,在miR-302c mimics+EGFR组,过表达EGFR后MGC-803细胞EMT相关蛋白的表达出现逆转（P<0.05）。而在SGC-7901细胞,miR-302c inhibitor组中SGC-7901细胞的Vimentin和Snail蛋白的表达均显著增加,而E-cadherin蛋白表达下降,在miR-302c inhibitor+siEGFR组,敲减EGFR后SGC-7901细胞的EMT相关蛋白的表达同样出现了逆转（P<0.05）。这些结果表明,miR-302c通过靶基因EGFR抑制了胃癌细胞的EMT。11.miR-302c通过EGFR调控胃癌细胞的迁移和侵袭:Transwell实验显示,和对照组相比,在miR-302c mimics组,MGC-803细胞的迁移和侵袭能力显著下降,在miR-302c mimics+EGFR组,过表达EGFR后MGC-803细胞迁移和侵袭能力重新增加（P<0.05）。而在SGC-7901细胞,miR-302c inhibitor组中SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力显著增加,在miR-302c inhibitor+siEGFR组,敲减EGFR后SGC-7901细胞迁移和侵袭能力重新下调（P<0.05）。这些结果表明,miR-302c通过靶基因EGFR抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭。12.miR-302c通过EGFR调控PI3K/AKT信号通路的活性:Western blot结果显示,和对照组相比,在miR-302c mimics组,MGC-803细胞的p-PI3K和pAKT蛋白的表达显著下降,而在miR-302c mimics+EGFR组,过表达EGFR后MGC-803细胞p-PI3K和p-AKT蛋白的表达出现增加（P<0.05）。而在SGC-7901细胞,miR-302c inhibitor组中SGC-7901细胞p-PI3K和p-AKT蛋白的表达显著增加,而在miR-302c inhibitor+siEGFR组,敲减EGFR后SGC-7901细胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表达出现下调（P<0.05）。这些结果表明,miR-302c通过靶基因EGFR抑制了胃癌细胞PI3K/AKT信号通路的活性。结论:1.miR-302c在胃癌组织和胃癌细胞株表达下调,低表达的miR-302c与更高的TNM分期和淋巴结转移显著相关,而与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小以及分化程度无关。2.miR-302c抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.EGFR是miR-302c的直接靶基因,在胃癌组织表达上调,并且和胃癌患者的生存预后相关。4.miR-302c通过靶向EGFR抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭,其分子机制为miR-302c下调EGFR/PI3K/AKT信号通路的活性,从而发挥了对胃癌细胞EMT的抑制作用。