论文部分内容阅读
油菜菌核病是我国油菜主要产区的重要病害,严重影响着油菜生产,目前防治菌核病的药剂主要是以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂。苯并咪唑类杀菌剂主要通过与病原菌β-微管蛋白结合,抑制微管的功能,阻止细胞的有丝分裂,抑制病原菌生长。由于这类药剂的高度专化性,作用位点单一,加上施用频率高,一般使用2～3年后许多病原菌很快会出现抗药性问题。现有研究证明,β-微管蛋白198位氨基酸由谷氨酸（Glu）突变为丙氨酸（Ala）是导致核盘菌（Sclerotinla sclerotiorum（Lib.）de Bary）产生对多菌灵田间抗药性的主要原因。 为了快速、准确检测和监测S. sclerotiorum的田间抗药性菌株频率,根据MBCHR菌株的点突变设计了2种实时定量PCR检测方法:第一种方法利用两条两端分别标记了不同发光基团的Taqman荧光探针可以与各自模板特异性结合发出不同荧光的原理来定量敏感和抗性核盘菌的数量;第二种方法在ASO-PCR检测技术的基础上结合了SYBR GREEN I荧光染料可以与双链DNA结合发光的的原理实现了对抗性核盘菌和全体样本的实时定量检测。 在Taqman荧光探针实时定量PCR方法的研究中,设计了一对可以扩增出包含突变位点片段的通用引物TYF、TYR和敏感探针（5’端发光基团标记为Rox,3’端淬灭基团为Tarma）及抗性探针（5’端发光基团标记为Fam,3’端淬灭基团为Tarma）,以期能在同一个反应管中同时获得敏感病原菌总数和抗药性病原菌总数等数据。实验中对反应体系进行了反复优化,未能实现同时检测:并且抗性探针的特异性较差,不能保证与抗性模板的特异性结合,因此TaqMan荧光探针多重定量PCR技术不适用于油菜菌核病菌对多菌灵抗药性突变这一单碱基的点突变类型的检测。 在SYBR GREEN I荧光染料实时定量PCR方法的研究中,根据ASO-PCR检测的原理用198位突变密码子作为3’末端碱基设计了1对引物RFP4、RRP来扩增产生突变的抗性核盘菌β-微管蛋白基因片段,根据S. sclerotiorum β-微管蛋白基因内含子与其它常见丝状真菌的差异设计了特异性引物SclSF、SclAF来扩增核盘菌的特异性片段,这样通过这两对引物的特异性保证了检测的可靠性和准确性;在定量方法上,选用SYBR GREEN I荧光染料使检测灵敏度大为提高,可以检测出0.0028ng（3.17×103copy）的模板含量,是普通ASO-PCR方法的十倍以上;采用从菌核直接提取基因组DNA的方法,并且不需要对每个菌株单独处理,大大节省了检测时间和工作量,该方法从基因