目的:血管衰老是血管细胞（内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）衰老的综合效应,其在血管狭窄、动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）等生理和病理过程中发挥着重要作用。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）作为构成血管壁的主要细胞类型,其衰老是驱动血管老化性疾病发生发展主要驱动力。先前研究证实,在血管损伤造成的新生内膜形成中,衰老的VSMCs发生增殖、迁移、炎症反应和胶原沉积等。虽然已有研究证实血管细胞衰老参与血管病理性重构,但关于衰老促进血管损伤后新生内膜形成的机制仍不清楚。我室前期研究表明,SIRT1基因外显子2-7产生的环状RNAs（circ RNAs）circ-Sirt1能够抑制VSMC炎性表型转化和新生内膜的形成。以往研究证实VSMC的过度增殖可以导致复制性衰老的产生,表明复制性衰老与VSMC增殖密切相关。然而,circ-Sirt1在抑制血管炎症和新生内膜形成过程中对VSMC衰老的影响仍有待进一步阐明。本研究利用C57BL/6J小鼠建立颈动脉损伤狭窄模型并以VSMCs作为研究对象,从整体、细胞以及分子水平探寻circ-Sirt1与VSMCs衰老和新生内膜增生之间的关系及其调节机制。方法:利用C57BL/6J小鼠构建颈动脉损伤狭窄模型,使用SA-β-gal染色、Western blot以及q RT-PCR实验方法进行评价circ-Sirt1与衰老相关新生内膜增生之间的关系。利用RNA-pull down和质谱分析技术探寻与circ-Sirt1相互结合的蛋白。从RNA和蛋白质相互作用的角度进行探讨circ-Sirt1对p53活化以及核转位的影响。结果:1.circ-Sirt1抑制VSMC衰老1.1 circ-Sirt1在老年小鼠动脉和新生内膜中表达下调为验证circ-Sirt1与血管衰老之间的关系。选取年轻与老年小鼠颈总动脉。通过q RT-PCR和RNA荧光原位杂交检测circ-Sirt1的表达,结果发现,与年轻小鼠相比,老年小鼠颈总动脉组织中circ-Sirt1表达降低,同时衰老标志物p53和p21表达升高。为了研究circ-Sirt1表达与血管内膜增生和VSMC衰老的关系,我们通过颈总结扎手术建立小鼠颈动脉损伤狭窄模型。SA-β-gal染色与免疫荧光染色检测发现,与血管中膜相比,SA-β-gal阳性染色在新生内膜中显著增加,并且主要为ACTA2阳性细胞。通过q RT-PCR和RNA荧光原位杂交检测circ-Sirt1的表达,结果显示在新生内膜形成过程中circ-Sirt1表达减少。提示VSMC衰老可能与circ-Sirt1表达降低有关。为了进一步证实circ-Sirt1与衰老之间的关系。体外使用AngⅡ处理VSMCs以构建细胞衰老模型。通过SA-β-gal染色和Western blot检测发现,经AngⅡ处理后,SA-β-gal阳性细胞明显增多,衰老标志物p21、p53和γ-H2AX表达增加,增殖标志分子PCNA水平下降。q RT-PCR证实circ-Sirt1在衰老的VSMCs中表达降低。以上结果表明,在新生内膜形成过程中,快速增殖的VSMCs发生衰老,并且伴有circ-Sirt1表达降低。1.2 circ-Sirt1抑制VSMC衰老为了进一步探究circ-Sirt1与VSMC衰老之间的关系。通过腺病毒过表达和si RNA敲低的方式干预circ-Sirt1的表达。SA-β-gal染色和Western blot检测发现,敲低circ-Sirt1促进AngⅡ诱导的VSMC衰老,过表达circ-Sirt1抑制AngⅡ诱导的VSMC衰老。此外,在PDGF-BB诱导的VSMC衰老中也观察到了类似的变化。我们先前研究已证实,circ-Sirt1可以在转录后水平上调SIRT1蛋白的表达,且SIRT1可使衰老调节因子p53去乙酰化失活。Western blot证实circ-Sirt1在AngⅡ诱导的衰老VSMCs中同样可以上调SIRT1蛋白表达,并且促进p53的去乙酰化失活。为了确认circ-Sirt1抑制VSMC衰老是否完全依赖于SIRT1的作用。在过表达circ-Sirt1的VSMCs中,我们使用SIRT1特异性抑制剂Ex527失活SIRT1,然后通过SA-β-gal染色和Western blot检测Ex527对circ-Sirt1抗衰老作用的影响,结果发现,Ex527并不能完全抑制circ-Sirt1的抗衰老作用。提示circ-Sirt1抑制p53介导的细胞衰老,不完全依赖于SIRT1。1.3 circ-Sirt1抑制VSMC增殖和迁移以往研究证实,AngⅡ和PDGF-BB不仅可以诱导细胞衰老,也可以促进VSMC的增殖和迁移。为了确定circ-Sirt1对VSMC迁移的影响,在过表达circ-Sirt1基础上使用AngⅡ或PDGF-BB分别处理VSMCs,通过细胞划痕实验发现circ-Sirt1可以抑制AngⅡ和PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移。2.circ-Sirt1抑制VSMC衰老的分子机制2.1 circ-Sirt1与p53相互作用研究表明,circ RNAs可通过绑定结合蛋白质并影响其亚细胞定位,从而参与调节蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA的相互作用。为了进一步研究circ-Sirt1抑制衰老的机制,我们在AngⅡ诱导的衰老VSMCs中寻找与circ-Sirt1相互作用的蛋白。通过RNA pull-down结合质谱分析寻找衰老VSMCs中与circ-Sirt1相互作用的蛋白,并对潜在相互作用蛋白进行GO富集分析,发现其中抑制细胞周期进程的转录调控因子p53。通过RNA pull-down结合Western blot和RIP实验证实circ-Sirt1与p53的相互作用。以上结果提示,circ-Sirt1可能通过与p53相互作用进而抑制VSMC衰老。2.2鉴定circ-Sirt1与p53存在相互结合为了找出circ-Sirt1与p53相互作用的可能区域,我们使用Mfold预测circ-Sirt1的二级结构,在二级结构基础上用RNA composer软件建立circ-Sirt1的三级结构模型。在分子空间结构的基础上通过NPDock软件对circ-Sirt1和p53进行分子对接。结果显示,circ-Sirt1与p53之间的相互作用区域位于nt 729-792。为了验证这一预测结果,我们构建了p53结合位点突变的circ-Sirt1过表达载体,并合成了与nt 729-792互补的寡核苷酸片段。RNA pull-down结果发现,当细胞过表达circ-Sirt1时,circ-Sirt1探针结合更多的p53蛋白。但在转染circ-Sirt1突变体质粒或互补寡核苷酸片段的VSMCs中,p53与circ-Sirt1的相互作用减弱。RIP实验进一步证实了上述实验结果。2.3 circ-Sirt1抑制AngⅡ诱导p53核转位前面实验结果已显示,过表达circ-Sirt1可以抑制p53蛋白的表达。q RT-PCR进一步证实,过表达circ-Sirt1也可降低p53 m RNA的表达。已有文献报道显示肿瘤细胞中转录调控因子p53存在转录自激活效应。在衰老的VSMCs中,通过Ch IP实验证实也存在p53转录自激活效应。由此我们推测circ-Sirt1与p53的相互作用是否将p53锚定在细胞质中,进而影响p53及下游靶基因的表达。为了验证这一假设,我们使用q RT-PCR和RNA荧光原位杂交检测细胞质和细胞核组分中circ-Sirt1的表达,结果显示circ-Sirt1主要存在于VSMCs的细胞质中。免疫荧光显示,AngⅡ可以诱导p53的核转位。过表达circ-Sirt1可显著抑制p53核转位。以上结果提示,circ-Sirt1可能在细胞质中与p53相互作用进而影响其核转位激活。2.4 circ-Sirt1抑制AngⅡ诱导NF-κB核转位课题组先前研究已经证实,circ-Sirt1可以与NF-κB p65直接相互作用进而抑制其核转位激活。为了确定circ-Sirt1对NF-κB p65的抑制作用是否存在于细胞衰老过程中,我们使用免疫荧光染色检测了NF-κB p65的核转位激活过程。结果显示,AngⅡ可以促进NF-κB p65的核转位,过表达circ-Sirt1可以抑制NF-κB p65核转位。基于以往研究证实的NF-κB对p53激活作用,Ch IP实验证实过表达circ-Sirt1抑制了NF-κB与p53启动子中反应元件的结合。以上结果表明,circ-Sirt1对VSMC衰老的抑制作用可能与抑制NF-κB p65活化有关。3.体内过表达circ-sirt1可抑制血管衰老相关新生内膜增生3.1 circ-Sirt1抑制血管衰老相关新生内膜增生在体内,为了证实circ-Sirt1是否可以通过抑制血管衰老进而改善损伤诱导的新生内膜增生,我们使用F-127基质胶溶解Ad-Vector和Ad-circ-Sirt1病毒并孵育小鼠结扎后的颈总动脉。q RT-PCR结果显示,在Ad-circ-Sirt1孵育的颈总动脉中,circ-Sirt1的表达显著增加。HE结果显示,过表达circ-Sirt1可显著抑制血管损伤后的内膜增生。SA-β-gal染色和Western blot结果发现,结扎损伤14天后,与对照组相比,在过表达circ-Sirt1的动脉中SA-β-gal阳性细胞数量减少,同时衰老标志分子p53和p21表达下调。以上结果证实,circ-Sirt1可以抑制血管衰老相关新生内膜增生。3.2 circ-Sirt1参与血管衰老相关AS形成为了探讨类似的调控机制是否存在于AS的形成过程中,我们利用Apo E-/-小鼠构建AS模型。油红O染色结果显示,Paigen饮食8 w的Apo E-/-小鼠在主动脉窦和主动脉弓显示出明显的油红O着色,提示造模成功。免疫荧光染色和SA-β-gal染色显示,在Apo E-/-小鼠的AS病变处,p53和SA-β-gal阳性染色面积显著增加,并且与ACTA2共定位。q RT-PCR结果显示,与WT小鼠相比,circ-Sirt1在AS血管组织中的表达降低。提示circ-Sirt1通过抑制VSMCs中p53的激活来延缓衰老的调节机制可能也存在于AS的形成过程中。3.3 circ-Sirt1在血管重塑性疾病患者中表达降低血管重塑性疾病主要包括动脉瘤、血管狭窄、AS、肺动脉高压、以及高血压等疾病,这些疾病一直影响着人类的身体健康。多种因素导致的VSMC衰老在血管重塑性疾病中发挥重要作用。因此,为了进一步探索circ-Sirt1在衰老相关血管疾病中的作用,我们收集了临床高血压或动脉粥样硬化伴肾切除患者的肾动脉临床样本。AS患者的肾动脉壁表现为明显内膜增生。免疫荧光和SA-β-gal染色显示,肾动脉新生内膜中p53阳性细胞显著高于正常对照组,并且伴有SA-β-gal染色增加。q RT-PCR结果显示,AS或高血压患者血管组织中circ-Sirt1水平显著降低。以上结果证实,circ-sirt1表达抑制通过诱导衰老而参与新生内膜增生和AS的形成。靶向circ-Sirt1可能是延缓衰老相关血管疾病的一种新型治疗策略。结论:1.circ-Sirt1在老年小鼠动脉和新生内膜中表达下调。2.circ-Sirt1抑制VSMC衰老与迁移。3.circ-Sirt1表达定位于胞浆,通过与p53相互作用,进而将其滞留在胞浆,从而抑制p53核转位激活。4.体内过表达circ-sirt1可抑制衰老相关新生内膜增生和AS的形成。5.circ-Sirt1在血管重塑性疾病患者中表达下调。