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背景:ALK基因重排是肺腺癌中非常重要的驱动基因,ALK融合基因的常见易位伴侣是EML4基因,NSCLC中大约有4-5%是EML4-ALK阳性患者。自从在NSCLC中发现EML4-ALK融合以来,针对ALK的多种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）已经被开发出来并作为这些患者的一线治疗策略,这些靶向药均是针对异常活化的致癌ALK融合蛋白,面临着治疗后续耐药、耐药突变等问题。因此,这更迫使我们进一步深入研究这些染色体易位发生的确切机制、关键的调控分子/蛋白,开发新型治疗靶点。我们首次发现ALK基因的重排断裂点全部集中在其19号内含子区域,这是一段＜2千碱基（kilobases,kb）片段,我们推测这段区域内很可能蕴藏着ALK基因的重要“重排调控单元”。因此,本研究基于之前的研究提出了染色体重排发生机制的全新假设:在肿瘤微环境突变压力驱动下,ALK基因19号内含子区域与重排伴侣基因EML4发生共聚,形成“染色质DNA-调控蛋白”组成的染色体重排调控体简称“重排染色质复合物”,重排染色质复合物形成后启动修复而发生重排。研究目的:本研究旨在绘制EML4-ALK易位阳性肺腺癌中重排染色质复合物的蛋白图谱及关键蛋白的相关调控机制。研究方法:（1）采用本实验室开发的创新性的染色质末端标记捕获试验（Chromatin end-labeling trap assay,CELT）-定量质谱的方法捕获了ALK 19号内含子处特异性结合的蛋白,绘制了染色体重排染色质复合物的特异性蛋白图谱;（2）采用RNA-seq、实时定量PCR、Western Blot等多种方法分析特异性重排染色质复合物蛋白的表达水平,并且用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）方法来观察蛋白的细胞内定位以及表达模式;构建了目的重排染色质复合物蛋白稳转敲低细胞系并检测ALK融合蛋白及转录本的表达情况改变;（3）用来自化脓性链球菌的II型效应蛋白（Type II effector protein Cas9 from Streptococcus pyogenes,Sp Cas9）和来自脑膜炎的正交Cas9（orthogonal Cas9 from either N.meningiditis,Nm Cas9）,首次构建了Sp Cas9 WT-Nm Cas9 WT双核酸酶诱导EML4-ALK variant 1系统评估目的重排染色质复合物蛋白对染色体重排效率的影响;（4）应用Ch IP-seq检测了ALK易位阳性和对照细胞系的H3K27ac峰分布。应用染色质构象捕捉（Chromosome conformation capture,3C）技术来检测sh NC和重排染色质复合物蛋白敲低细胞系中的EML4染色质内环结构变化;（5）应用DNA甲基化分析检测ALK易位阳性细胞系的EML4启动子区域甲基化情况,并检测重排染色质复合物蛋白是否参与影响EML4启动子区域的甲基化;并应用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）来验证蛋白之间的相互结合;研究结果:1.本研究创新性地采用全新的实验技术染色质末端标记捕获试验（Chromatin end-labeling trap assay,CELT）,捕获了EML4-ALK易位阳性的肺腺癌细胞系中ALK 19号内含子区域上特异性结合的蛋白,首次绘制了染色体重排染色质复合物中的蛋白图谱。2.筛选出重要的重排染色质复合物中的特异性蛋白:SATB2、DAXX、DCAMKL1,并用IF方法验证了核定位。3.应用sh RNA敲低验证了SATB2、DAXX、DCAMKL1在融合基因ALK基因表达中发挥作用;进一步应用Ch IP-seq和3C实验验证了EML4-ALK易位阳性的肺腺癌细胞的EML4启动子和多个增强子之间存在染色质内环,并且SATB2、DAXX和DCAMKL1蛋白参与了这种染色质内环的形成;甲基化实验验证了SATB2、DAXX和DCAMKL1蛋白并不影响EML4启动子区域的甲基化状态。4.应用Sp Cas9 WT-Nm Cas9 WT双核酸酶诱导EML4-ALK variant 1模型检测到,特异性敲低蛋白SATB2、DAXX和DCAMKL1均显著降低了断裂诱导EML4-ALK variant 1修复产物的表达量及比例;5.应用Co-IP实验验证了重排染色质复合物中的关键蛋白SATB2,DAXX和DCAMKL1之间存在相互作用,可作为蛋白复合体发挥功能;结论:本研究首次解析了肺腺癌中重要的EML4-ALK染色体易位的复杂发生过程,创新性地绘制了EML4-ALK重排染色质复合物的蛋白图谱,同时我们筛选出关键的重排染色质复合物蛋白SATB2、DAXX和DCAMKL1,并解析其在染色体易位中的双重调控机制。一方面,这些蛋白在染色体易位的过程中被招募到重排染色质复合物中,发挥重要的调控作用,从而影响染色体重排效率;另一方面,在染色体易位形成后,这些关键的蛋白仍然停留在融合位点区域发挥表观调控机制,通过参与染色质内环形成等空间结构来促进ALK致癌融合蛋白的表达,从而驱动肿瘤的发生发展。本研究为染色体易位的发生机制及肿瘤的发病机制研究打开了新视角,也为探索全新的靶向EML4-ALK重排染色质复合物本身的精准治疗策略提供了新思路和重要基础。