第一部分lncRNA DGCR5在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义目的:检测长链非编码RNA DiGeorge综合征临界区基因5（digeorge syndrome critical region gene 5,DGCR5）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中的表达水平,并分析其表达水平与ESCC患者临床病理特征和预后的相关性。方法:1.利用生物信息学方法对TCGA数据库中ESCC数据集的DGCR5基因的表达进行分析。2.收集2016年8月至2017年3月河北医科大学第四医院手术切除70例ESCC患者的癌及癌旁组织标本,应用RT-qPCR法检测70例食管鳞癌组织及相应癌旁组织中DGCR5表达水平。3.根据DGCR5在食管鳞癌组织中的表达水平,Log-rank Test法分析ESCC组织中DGCR5的表达水平高低与ESCC患者临床病理参数的相关性。4.Kaplan-Meier法分析DGCR5表达与ESCC患者生存的相关性。5.采用单一变量和多变量Cox回归模型评估DGCR5的表达水平高低对ESCC患者预后的影响。结果:1.TCGA数据库分析结果显示,DGCR5在ESCC组织中的表达水平显著高于正常食管组织（P＜0.01）。2.70例ESCC组织中共41例（58.57%）高表达DGCR5,29例（41.43%）低表达DGCR5。与相应癌旁组织相比,食管鳞癌组织中DGCR5表达明显上调（P＜0.01）,与TCGA数据库分析结果相一致。3.对70例ESCC患者的DGCR5表达水平与临床病理学指标的相关性进行分析,结果显示ESCC患者中DGCR5表达水平与TNM分期、肿瘤浸润程度和淋巴结转移呈显著性相关（均P＜0.01）,但与患者性别、年龄无关（P＞0.05）。4.Kaplan-Meier生存分析显示,高表达DGCR5的ESCC患者2年无病生存率显著低于低表达DGCR5患者（P＜0.01）。5.通过单因素分析发现TNM分期,淋巴结转移和DGCR5表达是影响ESCC患者预后的重要因素（P＜0.01）。此外,基于多变量Cox回归模型分析显示DGCR5表达是影响ESCC患者预后的独立危险因素（P＜0.01）。小结:1.DGCR5在ESCC组织中表达水平明显高于癌旁组织,与TNM分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移和预后不良密切相关。2.DGCR5是影响ESCC患者预后的独立危险因素,可成为ESCC早期诊断和预后评价的重要生物标志物。第二部分lncRNA DGCR5对食管鳞状细胞癌生物学功能的影响目的:探讨DGCR5对ESCC细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡恶性生物学行为的影响方法:1.RT-PCR和RT-qPCR方法检测食管鳞癌细胞系（TE1,Kyse170,Yes-2,Kyse150和Eca9706）中DGCR5的表达水平,筛选DGCR5表达较高的细胞进行后续功能实验。2.构建敲低或过表达DGCR5基因的食管鳞癌细胞系,RT-qPCR法检测敲低或过表达DGCR5基因的转染效率。3.应用CCK-8实验检测,敲低或过表达DGCR5基因后对TE1和Kyse170细胞增殖能力的影响。4.应用划痕愈合实验和Transwell小室实验检测,敲低或过表达DGCR5基因后对TE1和Kyse170细胞迁移能力的影响。5.应用Matrigel基质胶实验检测,敲低或过表达DGCR5基因后对TE1和Kyse170细胞侵袭能力的影响。6.应用流式细胞术检测,敲低或过表达DGCR5基因后对TE1和Kyse170细胞凋亡能力的影响。7.应用Western-blot方法检测,敲低或过表达DGCR5基因后对TE1和Kyse170细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果:1.DGCR5 在食管鳞状细胞癌 TE1,Kyse170,Yes-2,Kyse150 和Eca9706细胞系中为高表达,选择相对表达水平较高的TE1和Kyse170细胞进行后续实验研究。2.CCK-8法实验结果显示,敲低DGCR5基因表达可显著降低TE1和Kyse170细胞的增殖水平（P＜0.05）,过表达DGCR5基因可明显提高TE1和Kyse170细胞的增殖水平（P＜0.05）。3.划痕愈合和Transwell小室实验结果显示,敲低DGCR5基因表达能够显著抑制TE1和Kyse170细胞的迁移能力（P＜0.01）,过表达DGCR5基因能够促进TE1和Kyse170细胞的迁移能力（P＜0.01）。4.Matrigel基质胶实验结果显示,敲低DGCR5基因表达可明显抑制TE1和Kyse170细胞的侵袭能力（P＜0.01）,过表达DGCR5基因能够促进TE1和Kyse170细胞的侵袭能力（P＜0.01）。5.流式细胞术分析结果显示,敲低DGCR5基因表达可促进TE1和Kyse170细胞凋亡（P＜0.05）,过表达DGCR5基因表达可抑制TE1和Kyse170细胞凋亡（P＜0.05）。6.Western-blot方法分析结果显示,敲低DGCR5基因表达后,TE1和Kyse170细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表达降低,而促凋亡蛋白Bax表达水平明显升高（P＜0.05）;过表达DGCR5基因后,TE1和Kyse 170细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表达升高,而促凋亡蛋白Bax表达明显降低（P＜0.01）。小结:1.DGCR5在ESCC细胞中高表达,2.敲低DGCR5可抑制食管鳞癌TE1和Kyse170细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并促进其凋亡能力。3.过表达DGCR5可促进食管鳞癌TE1和Kyse170细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并抑制其凋亡能力。第三部分lncRNA DGCR5对食管鳞状细胞癌作用机制研究目的:探讨DGCR5在食管鳞状细胞癌中发挥作用的可能机制。方法:1.从TCGA在线数据库中筛选食管鳞癌中与DGCR5相关的基因,选取Pearson值＞0.5的基因,利用KEGG pathway分析,将这些基因的功能进行归类。2.通过核质分离实验和FISH实验明确DGCR5在ESCC细胞中的亚细胞定位。3.生物信息学预测与DGCR5相互作用的RNA结合蛋白,选择丝氨酸/精氨酸富集剪接因子 1（serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1）进行深入研究,并采用RNA结合蛋白免疫沉淀实验验证SRSF1蛋白与DGCR5可相互结合。4.利用RT-qPCR方法检测,敲低或过表达DGCR5基因后TE1和Kyse170细胞中SRSF1mRNA表达水平的变化,并采用Western-blot方法检测,敲低或过表达DGCR5基因后,TE1和Kyse170细胞中SRSF1蛋白表达的变化。5.流式细胞术检测DGCR5通过调控抗凋亡蛋白髓样细胞白血病-1（myeloid cell leukaemia-1,Mcl-1）表达对ESCC细胞凋亡能力的影响。6.应用RT-qPCR方法检测,敲低或过表达SRSF1基因后对TE1和Kyse170细胞中Mcl-1可变剪接亚型Mcl-1L和Mcl-1S的调控作用。7.应用Western-blot方法检测,敲低或过表达SRSF1基因后对TE1和Kyse170细胞中Mcl-1蛋白表达的影响。8.应用RT-qPCR方法检测,同时敲低DGCR5和过表达SRSF1,对TE1和Kyse170细胞Mcl-1L和Mcl-1S剪接亚型表达的影响。9.应用Western-blot方法检测,同时敲低DGCR5和过表达SRSF1,对TE1和Kyse170细胞Mcl-1蛋白表达的影响。结果:1.TCGA数据库中筛选出DGCR5在食管鳞癌中相关基因,选取Pearson值＞0.5的基因,共有178个,包括73个表达正相关和105个表达负相关基因。KEGG pathway分析发现DGCR5与细胞凋亡信号通路具有相关性。GESA分析结果显示DGCR5表达水平和凋亡信号通路之间呈负相关。2.DGCR5在食管鳞癌TE1和Kyse170细胞中主要定位于细胞核。3.StarBase在线数据库分析结果显示,DGCR5可与eIF4AⅢ、FMRP、FUS、LIN28A、SRSF1和UPF1蛋白相结合。基于文献报道和前期工作基础,选择SRSF1蛋白进行后续实验研究。RIP实验结果显示DGCR5可与SRSF1蛋白相互结合。4.RT-qPCR法分析结果显示,敲低或者过表达DGCR5基因对SRSF1基因表达水平无影响（P＞0.05）。Western-blot实验结果显示,敲低DGCR5基因表达能够抑制TE1和Kyse170细胞核中SRSF1蛋白表达,而过表达DGCR5基因能促进TE1和Kyse170细胞核中SRSF1蛋白表达（P＜0.01）。然而,敲低或过表达DGCR5对TE1和Kyse170细胞浆中SRSF1蛋白表达水平无影响（P＞0.05）。5.流式细胞术检测结果显示,敲低DGCR5基因表达可提高TE1和Kyse170细胞的凋亡能力,过表达Mcl-1基因表达可显著抑制TE1和Kyse170细胞的凋亡能力,而过表达Mcl-1基因同时敲低DGCR5表达可部分恢复抑制TE1和Kyse170细胞凋亡的能力（P＜0.01）。6.RT-qPCR方法检测结果显示,敲低SRSF1基因后抑制TE1和Kyse170细胞中Mcl-1L/Mcl-1S 比值的表达（P＜0.01）,过表达SRSF1基因后促进TE1和Kyse170细胞中Mcl-1L/Mcl-1S 比值的表达（P＜0.01）。7.Western-blot方法检测结果显示,敲低SRSF1基因后可显著抑制TE1和Kyse170细胞中Mcl-1蛋白的表达（P＜0.01）。过表达SRSF1基因后促进TE1和Kyse170细胞中Mcl-1蛋白表达（P＜0.01）。8.Rescue实验利用RT-qPCR方法检测结果显示,同时敲低DGCR5和过表达SRSF1基因,可部分恢复TE1和Kyse170细胞中Mcl-1L/Mcl-1S 比值表达水平（P＜0.01）。9.Rescue实验利用Western-blot方法检测结果显示,同时敲低DGCR5和过表达SRSF1基因,可部分恢复TE1和Kyse170细胞Mcl-1蛋白的表达水平（P＜0.01）。小结:1.在食管鳞癌细胞中,DGCR5定位于细胞核,且可与RNA结合蛋白SRSF1靶向结合。2.在食管鳞癌细胞中,SRSF1可调节食管鳞癌细胞Mcl-1的选择性剪接作用,并促进Mcl-1L亚型的升高,进而导致Mcl-1蛋白高表达。3.DGCR5通过靶向结合SRSF1蛋白调节Mcl-1选择性剪接影响食管鳞状细胞癌的抗凋亡作用。第四部分体内验证lncRNA DGCR5对食管鳞状细胞癌作用机制的研究目的:体内验证DGCR5对食管鳞状细胞癌的作用机制。方法:1.构建低表达DGCR5的Kyse170细胞系,将si-DGCR5和si-NC两组细胞悬液分别皮下注射至4周龄雌性BALB/c裸鼠右侧肩胛下,建立食管鳞癌裸鼠异种移植瘤模型。2.观察各组移植瘤的生长情况,并测量各组肿瘤大小及重量。3.RT-qPCR方法检测各组移植瘤组织中DGCR5、SRSF1和Mcl-1L/Mcl-1S表达水平。4.应用免疫组织化学染色法检测各组移植瘤组织中SRSF1和Mcl-1蛋白的表达水平。结果:1.肿瘤生长曲线显示,si-DGCR5组移植瘤生长速度明显低于si-NC组（P＜0.05）。取出移植瘤后称重,si-DGCR5组细胞在裸鼠体内形成的肿瘤大小明显小于si-NC组（P＜0.05）。2.RT-qPCR结果显示,与si-NC组相比,si-DGCR5组裸鼠移植瘤组织中DGCR5基因表达水平降低（P＜0.05）,Mcl-1L/Mcl-1S mRNA比值也显著较低,但SRSF1 mRNA的表达水平无统计学差异（P＞0.05）。3.免疫组织化学染色法检测结果显示,si-DGCR5组与对照组相比,裸鼠移植瘤组织中SRSF1和Mcl-1蛋白水平均明显下降（P＜0.05）。小结:DGCR5可通过调节SRSF1和Mcl-1蛋白的表达促进食管鳞癌细胞裸鼠异种移植瘤的生长,这揭示了 DGCR5/SRSF1/Mcl-1轴在裸鼠体内发挥致癌作用。结论:1.DGCR5在ESCC组织中表达上调,其高表达与ESCC患者TNM分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移和预后不良相关。2.DGCR5可促进ESCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并抑制其凋亡能力。此外,裸鼠成瘤实验表明,敲低DGCR5基因表达可抑制食管鳞癌细胞在裸鼠体内的生长。3.DGCR5可直接结合SRSF1蛋白并促进Mcl-1的选择性剪接事件,进而导致Mcl-1L亚型的升高,从而发挥其在ESCC中的促癌作用。