手足口病是儿童常见病,多种肠道病毒均可引起手足口病,其中肠道病毒71型(EV71)导致的手足口病重症患者比例以及病死率均明显高于其它肠道病毒,早期诊断对挽救重症患儿的生命极其重要。要降低重症手足口病病死率,关键在于要开发出一种能快速、准确诊断患儿是否感染EV71的检测试剂。胶体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观的优点,本研究利用该方法,成功开发了肠道病毒71型IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)。试验首先利用收集的血清建立肠道病毒EV71 IgM企业参考品,用于试剂盒的质量控制。通过试验确定企业参考品由12份阳性质控品、12份阴性质控品、1份重复性质控品和1份系列最低检出量质控品组成。其次,本试验利用鼠抗人-IgM抗体、兔IgG抗体、肠道病毒71型抗原和羊抗兔IgG多克隆抗体等原料进行工艺研究。通过试验确定了在硝酸纤维素膜(HF135)上包被2.0 mg/mL的肠道病毒71型抗原和1.0 mg/mL的羊抗兔IgG多克隆抗体,包被湿度环境为40～60%。采用大号胶体金进行标记,标记最适pH为8,鼠抗人-IgM抗体的最佳标记浓度为10μg/mL,最佳稀释浓度为1:10;兔IgG抗体的最佳标记浓度为15 μg/mL,最佳稀释浓度为1:15。反应体系采用10 μL血清/血浆加2滴稀释液,15-20分钟读取结果。最后,对EV71 IgM试剂进行企业参考品的评价、内源性干扰物质试验、交叉反应试验、不同抗凝剂的血浆样本试验、阳性样本破坏试验、稳定性试验、同类试剂比对试验及外部临床评价。结果表明,试剂盒性能优异,抗干扰能力强,与病原体结构相近或临床症状相似的其他常见病原体高浓度的特异性抗体血清无交叉反应,临床常用抗凝剂对血浆检测结果无影响,检测结果与国内同类试剂盒符合率高。本研究采用胶体金免疫层析技术,成功开发了肠道病毒71型IgM抗体检测试剂盒。该方法操作简单、快捷高效,可广泛应用于各基层医院、社区保健站等现场,有利于EV71感染的早期诊断,对该疾病的及时防控具有重要意义。