目的:近年来,随着糖尿病发病率在世界范围内的逐年上升,糖尿病及其并发症带来了深远的社会影响。糖尿病肾病（diabetes kidney disease,DKD）是糖尿病重要的并发症之一,目前占据中国终末期肾病病因的第2位和肾病住院病因的第1位。糖尿病肾病是一种以进行性肾纤维化为特征的肾脏疾病,发病机制尚不十分清楚,可能有多种因素参与。目前经典的DKD发病过程中是以肾小球理论为中心提出,但是近期研究发现,糖尿病肾病早期肾小管病变独立于肾小球病变更早的出现,并且严重肾小管病变的占比高于典型肾小球结构改变,这提示肾小管损伤性改变也是DKD的重要病理改变。因此,尽管肾小球在DKD发病过程中发挥着重要的作用,但是管间质才是疾病进程的主要“驱动力”。在肾小管结构改变机理中,的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）机制已成为当前研究的一个热门课题。研究结果表明,在肾脏上皮细胞中,阻断肾脏上皮细胞的EMT能有效地减少肾脏纤维化,改善肾脏功能,这说明,EMT的发生可能参与肾脏纤维化的发生发展过程,但目前对其分子调节机制的研究甚少。N-myc下游调节基因（N-myc downstream regulated gene,NDRG）家族是新发现的一族新基因,对其研究发现NDRG家族参与了EMT过程,NDRG过表达可以明显抑制细胞EMT的发生。NDRG家族成员NDRG1在肾脏表达丰富,但目前尚无关于NDRG1对糖尿病肾病EMT作用的研究。因此,本研究针对NDRG1在高糖诱导肾病模型过程中的具体调控作用进行深入研究,以期明确NDRG1基因参与糖尿病肾病的具体分子机制,为糖尿病肾病基础理论研究提供新的方向。研究方法:第一部分:全转录组测序分析用含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养肾小管上皮细胞HK2细胞,高糖组利用含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养HK2细胞,构建高糖诱导肾小管上皮细胞EMT模型,培养72小时后,收集细胞,行全转录组测序（transcriptome sequencing,RNA-seq）,将经分析得到的差异表达m RNA进一步进行GO分析和KEGG富集分析。根据结果,结合m RNA、mi RNA和circRNA测序结果,进一步分析内源性竞争抑制（Ce RNA）分析,获得候选Ce RNA调控网络。第二部分:NDRG1抑制高糖诱导肾小管上皮细胞的上皮-间质转化过程研究首先,分别在葡萄糖终浓度为5.6mmol/L、30mmol/L和45mmol/L的DMEM培养中培养HK2细胞,构建高糖诱导HK2细胞EMT模型。根据预实验结果,在随后的研究中,最终选择了30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基为造模浓度。以30mmol/L葡萄糖的高糖DMEM培养基培养HK2细胞,72小时后收集细胞,行实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）、Western-blot、免疫荧光分析NDRG1、信号传导与转录激活因子蛋白3（Signal Transducer And Activator Of Transcription 3,STAT3）、Snail家族转录抑制因子1（Snai1 family transcription suppressor 1,Snai1）、间质细胞标志物α平滑肌激动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）和上皮细胞标志物钙黏蛋白E（Epithelial cadherin,E-cadherin）表达量的变化。然后,分别构建NDRG1基因过表达、基因敲除慢病毒质粒p SLenti-SFH-NDRG1、p SLenti-U6-sh RNA-NDRG1及对照质粒p SLenti-SFH-NC和p SLenti-U6-sh RNA-NC,转染HK2细胞,72小时后收集细胞,然后经q RT-PCR测定、Western-blot分析和免疫荧光分析分别测定NDRG1,STAT3,Snai1,α-SMA和E-cadherin的m RNA改变和蛋白质表达量的变化。然后应用STAT3抑制剂JSI-124抑制HK2细胞内STAT3后,检测对NDRG1、STAT3、Snai1、E-cadherin和α-SMA表达量变化的影响。最后,实验中构建db/db 2型糖尿病小鼠自发性糖尿病肾病模型,每2周监测小鼠体重、血糖变化,20周龄后检测24h尿蛋白定量。处死小鼠后取肾脏组织,分别行:观察形态学改变的光镜（HE、Masson染色）和电镜检查;抗NDRG1、E-cadherin和α-SMA的免疫荧光检测;提取总RNA,检测肾组织内NDRG1、STAT3、Snai1、E-cadherin和α-SMA表达量变化情况。对照组选用db/m小鼠和C57BL/6小鼠。实验期间,小鼠给予标准食谱,自由进食水。第三部分:circRNA 1860/hsa-mi R-125b-5p/NDRG1 Ce RNA调控网络对EMT作用研究首先通过全转录组基因测序筛选候选的circRNA和mi RNA,通过q RT-PCR法检测高糖培养下HK2细胞候选circRNA和mi RNA表达量的变化,确定最终的Ce RNA调控网络为circRNA 1860/hsa-mi R-125b-5p/NDRG1。对比分别以convergent引物和divergent引物扩增的RT-PCR产物,以鉴定circRNA1860的环形结构。对比高糖下circRNA 1860和hsa-mi R-125b-5p的亚细胞定位,初预测circRNA1860/hsa-mi R-125b-5p是否通过Ce RNA方式调控NDRG1的表达。分别构建circRNA1860的过表达及敲除载体,转染HK2细胞,72h后收集细胞,q RT-PCR检测circRNA1860、hsa-mi R-125b-5p、NDRG1、α-SMA和E-cadherin的m RNA表达量变化情况;通过Western-blot法检测NDRG1、α-SMA和E-cadherin三种蛋白质的表达量变化。分别应用hsa-mi R-125b-5p的模拟物和hsa-mi R-125b-5p的抑制物,转染HK2细胞,72h后收集细胞,q RT-PCR检测hsa-mi R-125b-5p、NDRG1、E-cadherin和α-SMA;Western-blot法检测NDRG1、E-cadherin和α-SMA的蛋白质表达变化。最后应用AGO2-RIP及双荧光素酶法检测分析hsa-mi R-125b-5p与NDRG1 m RNA、circRNA1860和hsa-mi R-125b-5p的结合。结果:第一部分:肾小管上皮细胞高糖诱导EMT全转录组分析与对照组相比,全转录组高通量测序中共获得66072种基因m RNA的表达情况,高糖组差异表达基因共194个,其中上调131个,下调63个;共获得1050种mi RNA的表达,与对照组相比,高糖组差异表达mi RNA共24个,其中上调10个,下调14个;共获得6245种circRNA的表达情况,经对比,高糖组表达差异性显著的circRNA共39个,其中上调22个,下调17个。实验中分别选取了基因表达上升和下降的差异倍数最明显的前5位m RNA进行初步验证,5种上调m RNA分别为:EIF2S3B、SMIM15、SLC28A3、BASP1、C12orf45;5种下调的m RNA分别为:RIMBP3B、HSPA6、HID1、LAMP3、NDRG1。经q RT-PCR初步验证,确定的上调基因是EIF2S3B、SMIM15、BASP1,确定的下调基因是NDRG1。结合公共数据库查询比对上述蛋白的功能及通路,其中NDRG1与EMT相关。因此,在后续的研究中,实验研究了NDRG1在肾小管上皮细胞EMT的高糖诱导机制。经Targetscan和Miranda数据库的预测,候选的circRNA-mi RNA-m RNA Ce RNA网络共有26个circRNA节点,mi RNA节点共24个,m RNA 677个,组成5870种可能的候选Ce RNA互作网络。筛选其中NDRG1相关节点,获得5个circRNA节点,5个mi RNA节点,形成6种可能的互作网络,用于后续研究。第二部分:NDRG1抑制高糖诱导肾小管上皮细胞的上皮-间质转化过程研究在含30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养条件下,HK2细胞中E-cadherin m RNA的表达量下降,而α-SMA m RNA的表达量增多。Western-blot分析结果与q RT-PCR结果一致,高糖下,HK2细胞内上皮标记物E-cadherin蛋白表达量下降,α-SMA蛋白表达量增多。通过对细胞形态的观察,发现HK2细胞发生了楔形变,划痕实验及Transwell实验证明其迁移能力增强。这说明,在高糖条件下,HK2细胞发生了EMT。同时,通过q RT-PCR和Western-blot分析,高糖下HK2细胞内NDRG1的m RNA和蛋白表达量均下降,这说明NDRG1可能参与了高糖环境下HK2细胞的EMT过程。HK2细胞转染p SLenti-SFH-NDRG1慢病毒颗粒过表达NDRG1后,q RT-PCR和Western-blot结果显示,HK2细胞内NDRG1表达升高,STAT3,Snai1的表达下降,E-cadherin表达增多,α-SMA表达减少。转染p SLenti-U6-sh RNA-NDRG1敲除NDRG1后,HK2细胞内NDRG1的表达下降,STAT3,Snai1的表达量升高,E-cadherin的表达量下降,而α-SMA表达量增多。上述结果说明,NDRG1能够抑制EMT的发生,并可能与STAT3/Snai1通路有关。应用STAT3抑制剂JSI-124抑制HK2细胞内p STAT3后,Snai1表达下降,E-cadherin表达增多,α-SMA表达下降。并且JSI-124能够抑制过表达NDRG1所造成的EMT。上述结果进一步表明,NDRG1通过STAT3/Snai1通路抑制了高糖下HK2细胞EMT的发生。与对照组相比,db/db糖尿病肾病小鼠模型中,db/db组小鼠体型肥胖,饮水量增多,进食量增多,尿量增多。HE染色镜下可见体积增大的肾小球,肾小囊变小消失,肾小球基底膜增厚。在肾小管基底膜增厚的同时,肾小管结构内可见明显的细胞水肿的病理改变,肾小管上皮细胞内可见颗粒样和空泡样变性。Masson染色显示,肾小球内基底膜基质明显增多,基底膜增厚,肾小管基底膜蓝染的纤维蛋白原明显增多,肾小管基底膜增厚。电镜下,肾病组小鼠肾小球基底膜均质性明显增厚,系膜基质增多。肾小管上皮细胞线粒体数目减少,细胞形态肿胀,线粒体嵴结构紊乱。db/db组小鼠组织内NDRG1和E-cadherin表达量下降,STAT3、Snai1和α-SMA表达量上升。免疫荧光结果显示,肾病小鼠肾脏内E-cadherin表达量明显降低,α-SMA的表达量明显增多,NDRG 1在肾小管内表达量明显降低。并且,NDRG1蛋白只在肾小管内特异性表达,未在肾小球结构内观察到NDRG1的表达。第三部分:circRNA 1860/hsa-mi R-125b-5p/NDRG1 Ce RNA调控网络对EMT作用研究从全转录组高通量分析结果中筛选出可能与NDRG1基因表达有关的5种circRNA和5种mi RNA,经q RT-PCR验证后,最终选择circRNA 1860和hsa-mi R-125b-5p用于后续研究。circRNA 1860的Convergent引物能够使c DNA和g DNA均能扩增出条带,但是Divergent引物只能使c DNA扩增储条带,而g DNA不能扩增出条带。RNase处理后琼脂糖凝胶电泳显示circRNA1860条带仍然存在。测序鉴定结果显示circRNA 1860由FBXL5的2-10外显子反向剪切环化形成。因此,circRNA1860是环状结构。过表达circRNA1860后,与对照组相比,hsa-mi R-125b-5p的表达量明显降低,NDRG1 m RNA表达增多。而敲除circRNA1860后,hsa-mi R-125b-5p的表达量明显升高,NDRG1表达减少。Western-blot结果与q RT-PCR一致。证明circRNA1860可以促进NDRG1基因的表达,可能通过与hsa-mi R-125b-5p的竞争性结合发挥调控作用。应用hsa-mi R-125b-5p模拟物,转染HK2细胞后,q RT-PCR结果证明hsa-mi R-125b-5p表达量明显增加,而NDRG1 m RNA表达量下降;Western-blot结果表明,NDRG1蛋白表达量在hsa-mi R-125b-5p过表达后明显下降。相反地,NDRG1m RNA和蛋白表达水平在抑制hsa-mi R-125b-5p后有明显的升高。原位探针杂交结果显示circRNA 1860和hsa-mi R-125b-5p主要位于细胞质内。高糖下,circRNA 1860表达量明显下降,而hsa-mi R-125b-5p表达量明显上升,提示两者可能是通过竞争性抑制原理调控NDRG1基因的表达。AGO2-RIP结果显示AGO2与circRNA1860及hsa-mi R-125b-5p均有结合。双荧光素酶法检测结果显示NDRG1 m RNA的208-214位UUCAGGG能够与hsa-mi R-125b-5p的15-21位GAGUCCC结合。circRNA 1860的1759-1767位点GGUCUCAGGG碱基能够与hsa-mi R-125b-5p的12-21位点CCAGAGUCCC碱基特异性结合;初步证明了,circRNA 1860和hsa-mi R-125b-5p通过Ce RNA原理调控了NDRG1基因的表达。结论:NDRG1基因在高糖诱导的EMT过程中发挥了重要的调控作用。高糖下,NDRG1表达减少,激活STAT3/Snai1通路使肾小管上皮细胞发生EMT。高糖条件下NDRG1的减少与circRNA1860减少有关。在circRNA1860减少后,与hsa-mi R-125b-5p的竞争结合减少,hsa-mi R-125b-5p抑制了NDRG1的转录,调控了NDRG1的表达,进而引起EMT发生。本研究首次证明了NDRG1参与了高糖下肾小管上皮细胞EMT的发生,为糖尿病肾病的发病机理研究提供了新的理论基础。