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目的:本研究旨在探讨人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染对巨噬细胞抗马尔尼菲蓝状菌(Talaromycesmarneffei,TM)作用的影响及对巨噬细胞Toll样受体2/4(Toll-like Receptor2/4,TLRs2/4)通路的影响,探讨HIV损伤的巨噬细胞TLR2通路在巨噬细胞抗TM中的作用及分子机制。方法:采用了体外研究的方法,利用人单核细胞细胞系THP-1,通过乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbolmyristate acetate,PMA)(100 nM)诱导成 THP-1巨噬细胞,构建HIV/TM-巨噬细胞双感染模型。1、HIV感染对巨噬细胞抗TM作用的影响体外诱导获得THP-1巨噬细胞,用HIV Bal病毒感染(p24 20 ng/106细胞)或不感染巨噬细胞,感染后6h加入TM分生孢子感染(感染复数为2)进行TM感染,培养24小时,裂解细胞,通过倍比稀释接种于酵母浸出液培养基(YPD)上进行菌落计数实验(colony-formingunit,CFU)检测巨噬细胞内TM菌落数,观察HIV对巨噬细胞抗TM作用的影响。2、HIV感染对TLR信号通路的影响(1)THP-1巨噬细胞用HIV Bal病毒感染或不感染6小时,培养到特定时间,通过流式细胞术检测巨噬细胞TLR2和TLR4的蛋白表达情况。同时,采用实时荧光定量PCR检测下游细胞因子白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和干扰素γ(Interferon γ,IFNγ)转录表达水平,流式细胞仪液相蛋白定量技术(CBA)检测相应因子的蛋白表达水平,观察HIV对TLR2/4及下游细胞因子的影响。(2)THP-1巨噬细胞用TLR2激动剂酵母多糖(Zymosan)(10μg/ml)预处理6小时,分别用HIV Bal病毒感染或不感染巨噬细胞6小时,培养到特定时间,采用实时荧光定量PCR和流式细胞术检分别测TLR2在转录和蛋白水平的表达,实时荧光定量PCR和流式CBA分别检测下游细胞因子IL-10、IL-6和IFNγ转录和蛋白表达水平。观察HIV对TLR2通路激活的影响。3、在激活TLR2通路条件下,HIV感染对巨噬细胞抗TM的影响(1)TLR2通路激活对巨噬细胞抗TM的影响THP-1巨噬细胞用Zymosan(10μg/ml)预处理或不预处理6小时,TM分生孢子感染(感染复数为2)后,培养24小时,裂解细胞,通过CFU实验检测巨噬细胞内TM菌落数,观察TLR2激活对巨噬细胞内TM菌落数的影响。(2)在激活TLR2通路条件下,HIV感染对巨噬细胞抗TM的影响THP-1巨噬细胞用Zymosan(10 μg/ml)预处理6小时,HIV Bal病毒感染或不感染巨噬细胞6小时,TM分生孢子感染,通过CFU实验检测巨噬细胞内TM菌落数,观察TLR2通路激活后HIV对巨噬细胞内TM菌落数的影响。4、HIV感染对TLR信号通路抑制因子的影响THP-1巨噬细胞用Zymosan(10 μg/ml)预处理,预处理组和对照组巨噬细胞分别进行HIV Bal病毒感染,培养到特定时间,采用实时荧光定量PCR检测HES1、SOCS3、A20和ABIN-3的表达水平。结果:1、HIV感染减弱THP-1巨噬细胞抗TM作用HIV感染组与对照组相比,巨噬细胞感染TM后,CFU计数显著上升(P<0.05)。HIV感染减弱巨噬细胞抗TM的作用。2、HIV感染对巨噬细胞TLR2/4受体及通路下游细胞因子表达的影响(1)流式细胞术结果显示,HIV感染组巨噬细胞的TLR2细胞百分比和平均荧光强度均比对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);在TLR2通路激活的条件下,HIV感染的巨噬细胞的TLR2转录和蛋白水平仍呈现显著下降(P<0.05),表明HIV感染可降低巨噬细胞TLR2表达。而HIV感染组巨噬细胞的TLR4细胞百分比和平均荧光强度与对照组相比无统计学差异(P>0.05),表明HIV感染对巨噬细胞TLR4表达没有显著影响。(2)实时荧光定量PCR和CBA均显示,HIV感染可导致巨噬细胞IL-10和IL-6在转录水平和蛋白水平表达均明显升高(P<0.05),而促炎因子IFNγ的表达没有明显变化(P>0.05)。在TLR2通路激活的条件下,也观察到HIV感染的巨噬细胞在IL-10和IL-6转录水平和蛋白水平均显著上升(P<0.05),而IFNγ无明显的表达变化(P<0.05)。3、TLR2通路激活后,HIV对巨噬细胞抗TM作用的影响(1)TLR2通路激活可增强巨噬细胞抗TM的作用在TLR2通路激活的条件下,激活组巨噬细胞CFU菌落计数显著低于对照组巨噬细胞(P<0.05),TLR2通路的激活可增强巨噬细胞抗TM作用。(2)在TLR2通路激活的条件下,HIV感染减弱巨噬细胞抗TM作用在TLR2通路激活的条件下,HIV感染组的巨噬细胞中CFU菌落计数显著高于HIV未感染组巨噬细胞(P<0.05)。4、HIV感染可上调巨噬细胞TLR2通路限制因子的表达在TLR2激活或未激活的条件下,HIV感染可导致巨噬细胞ABIN-3、A20和SOCS3表达均显著性升高(P<0.05)。结论:本研究提示,HIV-1感染可通过抑制TLR2信号通路减弱巨噬细胞的抗TM作用,同时HIV-1感染上调促TM因子IL-10、IL-6的表达促进TM感染。本研究从巨噬细胞天然免疫的角度,初步揭示了 HIV促进TM感染的新机制,为HIV合并机会性感染提供基于天然免疫的预防和治疗新思路。