枇杷远缘杂种鉴定及花青素合成相关基因的表达分析

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普通枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)(2n=2x=34)是蔷薇科枇杷属中的唯一栽培种。故栽培枇杷遗传背景狭窄,而枇杷属野生资源的评价利用严重不足,众多枇杷的性状长期无法得到改良。枇杷属野生资源有较多的优良性状,其中台湾枇杷(Eriobotrya deflexa),花期为春末至初夏,熟期为夏末至初秋,果实黄红色,无毛,种子1-2,且高抗叶尖焦枯病,这些特征为枇杷熟期、果色、种子数量、抗性等性状改良提供了理想材料。迄今为止,枇杷育种方法仍以实生选种和杂交育种为主要手段,而远缘种间杂交的相关研究较少。本研究以枇杷品种‘宁海白’与台湾枇杷杂交的后代为材料,对后代进行倍性分析和杂种鉴定,并对其基因的表达情况进行初步研究。主要研究结果如下:1、枇杷远缘杂交后代的鉴定与真杂种的获得对‘宁海白’×台湾枇杷获得的后代进行倍性鉴定,发现杂交后代有二倍体和三倍体。对1年生植株进行形态观测,发现杂交后代的叶片形态总体介于亲本之间,且杂种后代均具有父本的托叶形态特征。以台湾枇杷g DNA为探针,GISH分析发现,二倍体和三倍体杂种中具有杂交信号的染色体数目相同。为了进一步明确三倍体的起源,筛选出5对SSR引物可对三倍体进行杂种鉴定,其中引物CH04c06可扩增亲本的2条特异条带,在三倍体中仅扩增出了1条父本(台湾枇杷)和2条母本(‘宁海白’)的特异条带。可见,不同倍性杂种后代均为真杂种,且三倍体是因雌配子(‘宁海白’)未减数(2n配子)而形成。2、亲本转录组分析分别取‘宁海白’、台湾枇杷不同发育阶段的叶片、茎尖混样进行转录组测序分析发现,茎尖比较组共有8566个差异表达基因,其中台湾枇杷上调基因3147个,下调基因5419个,差异表达基因主要富集在单萜生物合成、苯丙烷生物合成、氰氨基酸代谢、α-亚麻酸代谢、黄酮类生物合成和类胡萝卜素的生物合成等途径;叶片比较组共有9554个差异表达基因,其中台湾枇杷上调基因3842个,下调基因5712个,差异表达基因主要富集在碳代谢、糖酵解/糖异生、光合生物中的碳固定、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、过氧化物酶体和光合作用等途径;在两个比较组共筛选出花青素合成途径差异表达基因31个,主要为参与花青素合成的结构基因,表明调控花青素合成的结构基因在枇杷叶片呈色中起着重要作用。3、不同倍性材料中花青素途径关键基因的表达分析及克隆对亲本与杂交后代中花青素含量以及结构基因的表达进行分析,台湾枇杷叶片中花青素含量高,而‘宁海白’叶片中花青素含量非常低,这可能是台湾枇杷幼嫩叶片呈紫红色而‘宁海白’幼嫩叶片呈白色的主要原因。杂交后代中,不同发育阶段的三倍体叶片中花青素的含量均高于二倍体。可见,三倍体后代中花青素的合成活性高于二倍体。对花青素途径关键基因的表达量进行了检测,结果显示,叶片发育前期和后期(S1、S2和S4)多数关键基因组在三倍体中的表达量高于二倍体,中后期(S3)二倍体中表达量较高的基因组数量增多。可见,花青素合成基因的表达受基因组数量的影响,但不同时期的影响不同,总体来看三倍体中花青素合成受到了正向调控。此外,综合亲本和后代中花青素合成途径关键基因表达量进行分析表明,ANS、CHS、F3H和C4H可能是台湾枇杷相对于‘宁海白’花青素合成的主要差异基因。以台湾枇杷的c DNA为模板,成功克隆出来Ej ANS、Ej C4H、Ej CHS和Ej F3H基因的CDS全长。分析结果显示,上述基因的结构和细胞定位与苹果、梨的同源基因相近。本研究认为,利用枇杷与台湾枇杷可获得种间三倍体杂种;在‘宁海白’2n配子与台湾枇杷n配子结合形成的三倍体的叶片中,花青素的合成被正向调控。
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