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研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)目前已位世界常见病、多发病的第6位,是一种与年龄相关的慢性疾病,其发生的主要病理机制是成骨细胞(osteoblast,OB)的分化与增殖受到抑制,最终导致骨量减少和骨质疏松。目前对OP的治疗集中于抑制破骨细胞(osteoclast,OC)的功能,如双磷酸盐类和降钙素等,临床应用能增强OB功能的药物仅有甲状旁腺素(parathyroid-hormone,PTH)。长期的抗吸收治疗会导致骨更新过度抑制,造成旧骨累积,骨基质矿化期延长,最终骨骼脆性增加,骨折的发生率增加。因此,发掘具有增强OB活性的药物成为近年来OP研究的热点。生长分化因子11(growth difference factor 11,GDF11)属于生长转化因子-β(growth transformation factor-beta,TGF-β)超家族成员,参与调节多个系统和器官如骨骼系统、神经系统和肾脏等的发育,是胚胎中轴骨发育的重要调节因子,也是近年抗衰老研究的热点因子。GDF11可以改善因年龄衰老出现的机能下降,如骨骼肌损伤,心肌肥厚等,但随着研究的深入,其抗衰老作用受到质疑,有研究指出外源性补充GDF11不仅不能改善骨骼肌损伤,甚至诱发骨质疏松。到目前为止GDF11和骨代谢的研究甚少,文献报道补充GDF11可以治疗老年性OP,但也有研究认为GDF11抑制剂才是治疗老年相关性OP的有效药物。GDF11在骨形成过程中到底发挥怎样的作用,目前尚未见详细报道。维生素D是维持机体健康的重要营养物质之一,它的活性形式为1α,25(OH)2D3,在骨骼发育上发挥着至关重要的作用,主要通过1α,25(OH)2D3/VDR信号及OPG/RANKL系统来调节OB分化,但也有学者提出BMP-2/Smads/Runx2也是其调节途径之一。维生素D对OB增殖既有促进作用又有抑制作用,主要与维生素D含量有关。已知维生素D联合补充钙具有预防骨质疏松的作用,与GDF11联合补充发挥怎样的作用,目前并未有相关实验研究报道。第一部分GDF11对UMR106细胞增殖的影响目的探讨GDF11对培养的UMR106细胞增殖的影响及其作用机制。方法1.培养UMR106成骨样细胞并观察其形态。2.将成骨样细胞分为空白对照组和实验组。GDF11实验组分4组:50 ng/m L组、100 ng/m L组、200 ng/m L组、400 ng/m L组。3.采用MTT法检测成骨样细胞培养24、48和72h细胞增殖情况。4.采用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨样细胞培养24、48和72h细胞碱性磷酸酶(ALP)活性变化。5.采用qPCR技术测定成骨样细胞培养48h Runx2 m RNA和Osterix m RNA的表达。6.采用ELISA试剂盒测定成骨样细胞培养48h Runx2蛋白表达。结果1.培养的UMR106细胞早期贴壁呈圆形,逐渐铺展生长,形态多样,呈三角形、多角形、梭形、不规则形及纺锤形等;随着培养时间延长,细胞增殖呈集落生长趋势,以突起与周围细胞逐渐连接成片,与OB的形态特征和生长趋势相似。2.不同浓度的GDF11作用于成骨样细胞24、48和72h后,各组OD值均有变化。与对照组相比,50ng/m L和100 ng/m L组OD值增高(p<0.05),以100 ng/m L组48h增高最明显(p<0.01);200ng/m L和400 ng/m L组减少(p<0.05)。3.不同浓度的GDF11作用于成骨样细胞24、48和72h后,各组ALP活性均有变化。与对照相比,50ng/m L和100 ng/m L组活性增高(p<0.05),以100 ng/m L组48h增高最明显(p<0.01);400 ng/m L组降低(p<0.05)。4.不同浓度的GDF11作用于成骨样细胞48h后,各组Runx2 m RNA和Osterix m RNA表达均有变化。与对照相比,50ng/m L和100 ng/m L组Runx2 m RNA和Osterix m RNA表达均增加(p<0.05);400 ng/m L组Runx2 m RNA表达降低(p<0.05)。5.不同浓度的GDF11作用于成骨样细胞48h后,各组Runx2蛋白表达均有变化。与对照相比,50ng/m L和100 ng/m L组Runx2蛋白表达均增加(p<0.05);400 ng/m L组Runx2蛋白表达降低(p<0.05)。结论1.GDF11促进UMR106成骨样细胞增殖。2.GDF11可能通过激活Runx2信号通路,发挥促成骨样细胞增殖作用。第二部分GDF11和维生素D对UMR106细胞增殖的影响目的探讨GDF11和维生素D对UMR106细胞增殖的影响及其作用机制。方法1.培养UMR106细胞,将其分为空白对照组和实验组。实验组分5组:低浓度(50 ng/m L)GDF11组、中浓度(100 ng/m L)GDF11组、维生素D(10-6mol/L)组、50 ng/m L GDF11+维生素D组、100 ng/m L GDF11+维生素D组。2.采用MTT法检测成骨样细胞培养24、48和72h细胞增殖情况。3.采用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨样细胞培养24、48和72h细胞ALP活性变化。4.采用qPCR技术测定成骨样细胞培养24、48和72h Runx2 m RNA和Osterix m RNA的表达。结果1.与对照组相比,维生素D(24h)及联合GDF11均能促进成骨样细胞增殖(p<0.05),维生素D(48和72h)对成骨样细胞增殖无明显促进作用;维生素D与低浓度GDF11联合作用24、48和72h,对细胞增殖具有协同效应,而与中浓度GDF11联合为拮抗效应(p<0.05)。2.与对照组相比,除维生素D组,各组ALP活性明显增加(p<0.05)。3.与对照组相比,除维生素D、50 ng/m L GDF11+维生素D组,各组细胞Runx2m RNA表达均明显提高,Osterix m RNA只在24和48h高表达(p<0.05);与50 ng/m L GDF11组相比,50 ng/m L+维生素D组(24h)Osterix m RNA表达明显减少(p<0.05);与100 ng/m L GDF11组相比,100ng/ml+维生素D组(48h)Runx2 m RNA表达明显减少(p<0.01)。结论1.维生素D仅在短时间内促进成骨样细胞增殖,且可能部分或不通过Runx2信号通路发挥作用。2.维生素D与低浓度GDF11联合对成骨样细胞的增殖有协同效应,与中浓度GDF11联合为拮抗效应。小结1.GDF11可能通过激活Runx2信号通路,发挥促成骨样细胞增殖作用。2.维生素D仅在短时间内促进成骨样细胞增殖,且可能部分或不通过Runx2信号通路发挥作用。3.维生素D与低浓度GDF11联合对成骨样细胞的增殖有协同效应,与中浓度GDF11联合为拮抗效应。