猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVDs)的病原,主要侵害感染猪的免疫细胞,导致严重的免疫抑制,使感染猪对其他病原的易感性增高,引起多种疾病的发生,严重危害生猪健康养殖和猪病防控。PCV2是目前发现的感染哺乳动物最小的DNA病毒,基因组由1766～1768个核苷酸组成,对病毒致病机理的阐明是防控疾病的基础,明确编码蛋白在病毒致病中的作用是揭示其致病机理的重要方面。PCV2基因组结构简单,生物信息学软件分析发现其基因组中存在11个潜在的开放读码框(Open reading frames,ORFs),分别编码病毒的结构和非结构蛋白,在病毒致病中发挥作用,目前发现的只有6个ORFs(ORF1～6)。对新的ORF发现和鉴定将为PCV2病原学增加新成员,明确其在病毒致病中的作用,将为PCV2致病机理的揭示提供新的科学资料。我们发现PCV2基因组中存在一个保守的ORF,包含在ORF2基因中,在基因组的1524-1033核苷酸处(492 nt),理论上可编码164个氨基酸,预测蛋白分子量约为18 kDa。为了与已经报道的PCV2 ORFs的命名相衔接,暂将其命名为“ORF7”(简称ORF7)。本研究对ORF7在PCV2感染细胞中的表达进行检测,在证实ORF7确实存在的基础上,开展了ORF7对宿主细胞周期、细胞凋亡、细胞天然免疫因子表达和对PCV2复制的影响研究。获得了以下结果:(1)鼠抗ORF7蛋白多克隆抗体的制备。构建pGEX-6p-1-ORF7重组质粒,通过原核表达系统进行诱导表达,发现在IPTG 0.8 mmol/L、37℃下诱导12 h蛋白表达量最高,且主要在菌体沉淀中表达,pGEX-6p-1-ORF7重组蛋白大小约为44 kDa。将pGEX-6p-1-ORF7重组蛋白以切胶的方式纯化后与佐剂混合,免疫Balb/c小鼠4次后,ELIS A方法检测小鼠阳性血清效价为1:10 000;通过IFA试验可以特异性检测到PCV2感染PK-15细胞后ORF7蛋白的表达;Western blot试验可特异性识别pGEX-6p-1-ORF7和pCDH-CMV-Flag-ORF7重组蛋白的表达。说明制备的多克隆抗体可用于ORF7蛋白的检测。(2)PCV2感染PK-15细胞中ORF7的检测和鉴定。通过RT-PCR和RT-qPCR检测发现PCV2感染PK-15细胞后不同时间点,都可以检测到ORF7 mRNA;Western blot检测发现PCV2感染细胞中存在ORF7蛋白的表达。结果证实在PCV2感细胞过程中存在ORF7基因转录和蛋白表达。(3)ORF7蛋白对PK-15细胞功能的影响。以pCDH-CMV-Flag-ORF7重组质粒转染PK-15细胞,RT-qPCR检测发现在转染后36 h和48 h后内质网应激标志蛋白GRP78基因转录极显著上调;CCK-8法检测发现转染后12 h～48 h细胞活性增强,流式细胞技术检测发现转染细胞处于S期的数量极显著降低、凋亡细胞百分数降低。RT-qPCR和Western blot检测发现转染后12 h～48 h,宿主细胞Bcl-2和Bax的表达均上调,Bcl-2/Bax值升高,Caspase-8/3的表达下调,提示ORF7蛋白具有抑制细胞凋亡的作用;RT-qPCR、Western blot和ELISA检测发现转染细胞的TNF-α、NF-κB、IL-10和IFN-α的表达上调,IL-2和IL-12的表达下调。以PCV2感染转染细胞后,荧光酶标仪检测发现与PCV2感染的对照细胞相比,转染细胞的ROS水平降低。以上研究结果表明,ORF7蛋白抑制宿主细胞凋亡、促进天然免疫因子的分泌、降低了由PCV2引起的细胞ROS。(4)表达ORF7蛋白的PK-15细胞感染PCV2后病毒复制的检测。将pCDH-CMV-Flag-ORF7质粒转染PK-15细胞后感染PCV2,RT-qPCR检测发现感染后12 h～48 h,与对照细胞相比,转染细胞中PCV2 Cap基因mRNA降低。结果提示,细胞表达ORF7蛋白后接种PCV2会下调Cap基因转录。本研究从基因转录水平和蛋白翻译水平鉴定了 PCV2感染细胞中ORF7的表达;体外研究发现,ORF7蛋白能够促进PK-15细胞内质网应激反应、缩短细胞周期、抑制细胞凋亡、促进天然免疫应答,对PCV2复制产生影响,研究结果为PCV2致病机理的阐明提供了新的视角和科学资料。