乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染是全球性的健康问题,也是世界范围内导致慢性肝脏疾病最常见的原因。全世界共有3.5亿慢性HBV感染者,其中75%为亚洲人。多项研究表明,HBV基因型与慢性HBV感染的预后及治疗反应有密切的联系。B基因型感染者和C基因型感染者的临床预后显然不同,可能原因是不同的基因型有不同的复制和抗原决定簇。HBV基因型可能与临床预后相关的原因还不清楚。HBV基因型和基本核心启动子区(BCP)和前C区的变异也有密切联系。基因分型方法应该当作一种研究工具直到基因型知识能够用来预测严重结果的危险性(暴发肝炎,肝硬化,肝癌)或指导治疗方法(治疗方法的选择或治疗时间)。我国流行的HBV基因型主要为C型和B型。河南省漯河地区和黑龙江省肇东地区均属于HBV低度流行地区,本研究在2005年HBV感染的调查基础上研究两地区HBV基因型的流行情况和HBV BCP区和前C区的变异情况,为两地区乙肝防控提供一定的科学依据。本研究共分为两部分:第一部分:河南省漯河地区自然人群乙型肝炎病毒基因型的分子流行病学初步分析目的:了解河南省漯河地区自然人群HBV基因型、血清亚型分布情况及基因型与血清亚型的关系;分析HBV基因型与临床类型、HBeAg/抗-HBe血清学状况之间的关系;分析HBV基因型与血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的关系;了解自然人群中HBV S基因的核苷酸水平变异及氨基酸水平变异情况。方法:2005年以河南省漯河地区舞阳县舞泉镇、临颍县固厢乡、召陵区万金为研究现场,以居民为研究对象,对居民进行了一次横断面血清流行病学调查。2006年随访2005年HBsAg阳性者296人,采用固相放射免疫(SPRIA)法检测HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、HBeAg和抗-HBe五项乙肝病毒感染指标,综合ALT、B超和临床体检等结果,按照2005年12月10日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》和卫生部传染病标准专业委员会2007年提出的《乙型病毒性肝炎诊断标准》(报批稿)的诊断标准,选择可作出明确临床诊断的254例作为研究对象。其中无症状HBV携带者(ASC)144例,慢性乙型肝炎(CH)110例。男性136例,女性118例。平均年龄35岁。对从254例研究对象中抽取的血清标本采用巢式PCR法扩增HBV DNA。利用QIAamp DNA Blood Mini Kit,按照试剂盒操作说明书要求从200μl血清中提取HBV DNA,以其作为模板,分别设计合成2对引物扩增HBV S基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,直接将PCR产物送TaKaRa利用ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer测序。利用DNASTAR软件对测序标本的核苷酸序列与从GenBank中获取的HBV A-H各基因型标准序列进行比对分析,绘制基因进化树,确定基因型。由核苷酸序列推导氨基酸序列,确定血清亚型。应用统计分析软件SPSS13.0进行χ2检验,Fisher确切概率法,Wilcoxon秩和检验对实验结果进行统计学分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:254例血清标本中,HBV S区阳性者219例,阳性率为86.22%。219例标本的基因型分布为:B基因型22例,占10.05%;C型197例,占89.95%。血清亚型分布为:adr亚型192例,占87.67%;adw2亚型23例,占10.50%;ayr亚型3例,占1.37%;ayw1亚型1例,占0.46%。22例B基因型标本的血清亚型为:adw2亚型21例(占95.45%),ayw1亚型1例(占4.55%);197例C基因型标本的血清亚型为:adr亚型192例(占97.46%),adw2亚型2例(占1.02%),ayr 3例(占1.52%)。不同基因型的血清亚型构成差异有统计学意义(P=0.0000)。22例B基因型感染者中,15例(68.18%)为ASC,7例(31.82%)为CH;197例C基因型感染者中,109例(55.33%)为ASC,88例(44.67%)为CH。不同基因型的临床类型分布差异无统计学意义(P=0.2487)。小于30岁组不同基因型的HBeAg/抗-HBe的血清学分布差异无统计学意义(P=1.0000)。大于30岁组不同基因型的HBeAg/抗-HBe的血清学分布差异有统计学意义(P=0.0431)。B基因型感染者和C基因型感染者的ALT水平差异没有统计学意义(P=0.4023)。根据HBeAg/抗-HBe的血清学状况把感染者分层,HBeAg阳性的B基因型感染者和C基因型感染者的ALT水平差异没有统计学意义(P=0.2168),抗-HBe阳性的B基因型感染者和C基因型感染者的ALT水平差异也没有统计学意义(P=0.1229)。本次试验共获得219例HBV S基因600nt完整序列结果。分析发现184个位点有碱基替换现象,其中49个位点为同义突变,133个位点为错义突变,3个位点有无义突变。主要结构同源区(MHR,aa100-160)发现60个位点有碱基替换现象,其中35个位点有同义突变,36个位点有错义突变。错义突变中有2个位点产生了有意义的氨基酸突变—Q129H(2例),位于抗原决定簇a的第一个茎环结构内;G145R(1例),位于抗原决定簇a的第二个茎环结构内。HBV S基因每100个核苷酸替换的频数为0.83。HBV S基因每100个氨基酸替换的频数为1.00。结论:1河南省漯河地区的HBV基因型分布以C基因型为主,存在少量的B基因型。2河南省漯河地区的HBV血清亚型分布以adr亚型为主,存在少量的adw2、ayr和ayw1亚型。3 HBV不同基因型的血清亚型的构成不同。B基因型标本的血清亚型主要为adw2,有极少量的ayw1;C基因型标本的血清亚型主要为adr,有少量的adw2和ayr。提示HBV基因型与血清亚型存在一定的相关性。4大于30岁的B基因型感染者比C基因型感染者更有可能较早的出现HBeAg血清学转换。5 B基因型感染者与C基因型感染者的ALT水平没有差别。6 HBV S基因在许多位点有碱基替换现象,近2/3的位点碱基替换为错义突变。自然人群中存在一定的HBV S基因突变,发现1例疫苗相关突变。核苷酸替换的平均频数较低,提示S基因相当保守。第二部分:河南省漯河地区和黑龙江省肇东地区自然人群乙型肝炎病毒前C和C基因突变的分子流行病学初步分析目的:了解河南省漯河地区和黑龙江省肇东地区自然人群慢性HBV感染者HBV BCP区T1762/A1764、前C区A1896变异株的流行率;分析两种变异株感染与HBV基因型、HBeAg/抗-HBe血清学状态及疾病临床类型间的关系;了解两种变异株感染与ALT水平的关系。方法:河南省漯河地区:以第一部分254份血清中HBV S区PCR阳性者219份为研究对象。其中无症状HBV携带者(ASC)124例,慢性乙型肝炎(CH)95例。平均年龄38岁,男性121例,女性98例。黑龙江省肇东地区:2005年,以黑龙江省肇东地区双胜村和先锋村两个农村为研究现场,以全屯居民为研究对象,对全屯居民进行了一次横断面血清流行病学调查,采用固相放射免疫(SPRIA)法检测HBsAg、抗-HBs和抗-HBc三项乙肝病毒感染指标,采用酶联免疫(ELISA)法检测HBeAg和抗-HBe两项感染指标。结合1986年这两个现场的血清流行病学调查资料,综合ALT、B超和临床体检等结果,按照2005年12月10日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准,选择可作出明确临床诊断且HBV S区PCR阳性者97例作为研究对象。其中无症状HBV携带者(ASC)78例,慢性乙型肝炎(CH)12例。肝硬化(LC)3例,肝细胞肝癌(HCC)1例,恢复3例。平均年龄34岁,男性52例,女性45例。对从河南省漯河地区219例研究对象和黑龙江省肇东地区97例研究对象中抽取的血清标本采用巢式PCR法扩增HBV DNA。利用QIAamp DNA Blood Mini Kit,按照试剂盒操作说明书要求从200μl血清中提取HBV DNA,以其作为模板,分别设计合成2对引物扩增HBV C基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,直接将PCR产物送TaKaRa利用ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer测序,采用荧光标记双脱氧终止法测定所扩增的HBV C基因。在HBV C基因的测序结果中,利用DNASTAR软件推导出BCP区1762位和1764位的核苷酸序列,以及前C区1896位的核苷酸序列,与GenBank中的HBV参考株进行比对进而确定所获得的测序样本中发生BCP区和前C区突变的标本。应用统计分析软件SPSS13.0进行χ2检验,Fisher确切概率法,Wilcoxon秩和检验对实验结果进行统计学处理分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:河南省漯河地区分别有40.22%和52.51%慢性HBV感染者发生了HBV A1896和HBV T1762/A1764变异。黑龙江省肇东地区有28.57%的慢性HBV感染者分别发生了HBV A1896和HBV T1762/A1764变异。河南省漯河地区C基因型感染者BCP区发生T1762/A1764双突变的频率高于B基因型感染者(55.28%vs.27.78%,P=0.0267)。B基因型感染者和C基因型感染者发生前C区A1896突变的频率没有区别(50.00%vs.39.13%,P=0.3724)。黑龙江省肇东地区C基因型感染者BCP区发生T1762/A1764双突变的频率高于B基因型感染者(36.67%vs.0.00%,P=0.0231)。B基因型感染者和C基因型感染者发生前C区A1896突变的频率没有区别(33.33%vs.29.85%,P=0.8598)。河南省漯河地区BCP区T1762/A1764双突变的检出率高于黑龙江省肇东地区(55.51%vs.33.33%,P=0.0076)。河南省漯河地区和黑龙江省肇东地区前C区A1896突变的检出率没有区别(40.22%vs.30.14%,P=0.1331)。河南省漯河地区抗-HBe阳性HBV感染者发生BCP区T1762/A1764双突变的频率高于HBeAg阳性HBV感染者(76.67%vs.29.11%,P=0.0000)。抗-HBe阳性HBV感染者发生前C区A1896突变的频率高于HBeAg阳性感染者(70.21%vs.2.53%,P=0.0000)。黑龙江省肇东地区HBeAg阳性感染者和抗-HBe阳性感染者发生BCP区T1762/A1764双突变的频率没有区别(P=0.4092)。抗-HBe阳性感染者发生前C区A1896突变的频率高于HBeAg阳性感染者(66.67%vs.2.94%,P=0.0000)。河南省漯河地区BCP区T1762/A1764双突变感染者和野生型感染者的ALT水平没有差别(P=0.4387)。根据HBeAg/抗-HBe的血清学状况把感染者分层,HBeAg阳性组BCP区T1762/A1764双突变感染者的ALT水平高于野生型感染者(P=0.0000)。抗-HBe阳性组BCP区T1762/A1764双突变感染者和野生型感染者的ALT水平没有区别(P=0.4171)。河南省漯河地区前C区A1896突变感染者的ALT水平低于野生型感染者(P=0.0013)。根据HBeAg/抗-HBe的血清学状况把感染者分层,HBeAg阳性组前C区A1896突变感染者和野生型感染者的ALT水平没有区别(P=0.7578)。抗-HBe阳性组前C区A1896突变感染者的ALT水平低于野生型感染者(P=0.0082)。河南省漯河地区CH BCP区发生T1762/A1764双突变的频率高于ASC(63.16%vs.45.92%,P=0.0237)。ASC前C区发生A1896突变的频率高于CH(47.47%vs.31.25%,P=0.0277)。黑龙江省肇东地区ASC发生BCP区T1762/A1764双突变的频率和CH没有区别(P=0.3183)。CH前C区发生A1896突变的频率高于ASC(71.43%vs.24.24%,P=0.0133)。结论:1河南省漯河地区HBV BCP区T1762/A1764双突变的检出率明显高于黑龙江省肇东地区。河南省漯河地区与黑龙江省肇东地区HBV A1896突变的检出率没有差别。2河南省漯河地区抗-HBe阳性HBV感染者发生BCP区T1762/A1764双突变和前C区A1896突变的频率高于HBeAg阳性HBV感染者。3黑龙江省肇东地区抗-HBe阳性感染者发生前C区A1896突变的频率高于HBeAg阳性感染者4河南省漯河地区HBeAg阳性HBV BCP区T1762/A1764双突变感染者比野生型感染者有较高的ALT水平。5河南省漯河地区HBV前C区A1896突变感染者的ALT水平低于野生型感染者,抗-HBe阳性前C区A1896突变感染者的ALT水平低于野生型感染者,但HBeAg阳性前C区A1896突变感染者与野生型感染者的ALT水平没有区别。6河南省漯河地区和黑龙江省肇东地区C基因型感染者HBV BCP区T1762/A1764双突变的检出率均高于B基因型感染者,C基因型感染者和B基因型感染者前C区A1896突变的检出率没有差别。7河南省漯河地区CH BCP区发生T1762/A1764双突变的频率高于ASC。ASC前C区发生A1896突变的频率高于CH。8黑龙江省肇东地区ASC发生BCP区T1762/A1764双突变的频率和CH没有区别。CH前C区发生A1896突变的频率高于ASC。