【摘 要】
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目的:近年来,进展期肺癌的治疗方式有所转变,逐渐以免疫治疗为主,其它方式为辅的联合治疗方案。随着肿瘤免疫治疗药物相继在本土应用,尤其以抗PD-L1及其受体的药物表现出的抗肿瘤效果明显,使得癌症患者不断受益。早期临床探索发现,抗PD-L1及其受体药物具有明确的抗肿瘤活性、良好的免疫诱导反应等特点。但随着治疗的不断深入,免疫相关的不良反应逐渐凸显,有些反应甚至是致命性的。我们知道肿瘤有其复杂且独特的肿
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目的:近年来,进展期肺癌的治疗方式有所转变,逐渐以免疫治疗为主,其它方式为辅的联合治疗方案。随着肿瘤免疫治疗药物相继在本土应用,尤其以抗PD-L1及其受体的药物表现出的抗肿瘤效果明显,使得癌症患者不断受益。早期临床探索发现,抗PD-L1及其受体药物具有明确的抗肿瘤活性、良好的免疫诱导反应等特点。但随着治疗的不断深入,免疫相关的不良反应逐渐凸显,有些反应甚至是致命性的。我们知道肿瘤有其复杂且独特的肿瘤微环境,所有的治疗措施一般都需要先作用于肿瘤微环境才能起抗肿瘤效应。既往研究发现,缺氧作为肿瘤微环境中最重要的特征之一,普遍存在于实体肿瘤组织中。而缺氧微环境与免疫检查点的相关性机制仍不明确,迫切需要进一步研究。本课题研究缺氧微环境对肺癌细胞自噬和增殖的影响,观察在不同缺氧水平中肺癌细胞自噬相关通路蛋白、缺氧诱导因子的分子表达水平变化以及对细胞活性的影响情况,从而探究程序性死亡受体相关配体（programdeath ligand1,PD-L1）在缺氧诱导的自噬相关通路中的作用,给肿瘤微环境及免疫治疗的临床一线科研工作者提供一个全新的治疗思路。同时,可以尝试PD-L1免疫抑制剂、自噬抑制剂与缺氧治疗相结合,探索协同作用效应,为未来肺癌的免疫治疗提供新的治疗方法。方法:通过缺氧的培养环境,以缺氧诱导因子的蛋白表达水平为参照标准,构建一个肺癌的缺氧微环境模型。在此基础上,设置了对照组和实验组,对照组即为常氧组（Normoxia）、实验组又分为缺氧组和缺氧+3-MA药物干预组（分别为Hypoxia、Hypoxia+3-MA）,其中对照组为常氧培养环境,实验组为缺氧培养环境,缺氧+3-甲基腺嘌呤组给予3-MA进行药物干预,分别作用12、24及48小时。CCK-8进行不同作用时间点下肺癌细胞增殖活性的测定;Western蛋白印迹法检测不同条件下自噬及缺氧相关蛋白的表达水平;PCR测定蛋白激酶（AKT）、LC3-、PD-L1的基因表达水平。最后进行实验数据整理和相关统计学分析。结果:通过改变缺氧条件,我们构建了一个稳定的肺癌缺氧模型。在缺氧组中,随着缺氧时间的延长（12h-48h）,和常氧组相比,HIF-1α、LC3-II在蛋白表达水平逐渐升高,LC3-、PD-L1、AKT在基因水平逐渐升高,同时H1299肺癌细胞的增殖活性亦呈一个逐渐增长的趋势。本实验加入了特异性自噬抑制剂-3-MA进行药物干预后,在缺氧+3-MA组中,和缺氧组相比,HIF-1α、LC3-、PD-L1、AKT的分子表达水平呈明显下降的趋势（P<0.05）,细胞增殖活性明显降低。结论:缺氧的肿瘤微环境会促使H1299肺癌细胞发生一系列的适应性变化。在缺氧诱导下,H1299肺癌细胞自噬通路蛋白与PDL1有明显的相关性。PD-L1可能参与了H1299肺癌细胞自噬相关通路表达,可能与PI3K/AKT通道途径有关。3-MA可明显抑制肺癌细胞自噬通路蛋白及PDL1的表达,也可明显抑制肺癌细胞增殖。缺氧可能通过激活H1299肺癌细胞PI3K/AKT自噬通路途径,上调免疫检查点PD-L1、自噬通路蛋白LC3-II表达,促进肺癌细胞的增殖。
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