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目的： 制备粒细胞样髓源性抑制细胞（granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSC)来源的外泌体（exosomes），观察G-MDSC来源exosomes（G-exosomes）对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen-inducedarthritis,CIA）发生发展的影响，探究G-exosomes携带的miRNA在其发挥免疫抑制功能中的作用及其机制。 方法： （1）G-exosomes和M-exosomes的与鉴定 通过皮下注射肺癌细胞（Lewis）构建小鼠移植瘤模型，磁珠分选小鼠脾脏中的 G-MDSC和单核细胞样髓源性抑制细胞（monocytic myeloid-derived suppressor cells,M-MDSC)并体外培养，利用膜超滤技术和外泌体提取试剂盒制备G-exosomes和M-MDSC来源exosomes（M-exosomes）。通过透射电子显微镜观察G-exosomes和M-exosomes的形态及大小，利用Western blot技术检测CD9、CD63以及钙连接蛋白（Calnexin）的表达。 （2）G-exosomes和M-exosomes在CIA模型小鼠中的作用 通过第0天牛-II型胶原（C-II）和弗氏完全佐剂的乳化物初次免疫，以及第21天C-II和弗氏不完全佐剂的乳化物二次免疫，构建CIA模型小鼠。尾静脉注射G-exosomes或M-exosomes，以中性粒细胞分泌的exosomes（N-exosomes）作为对照。在小鼠发病过程中，记录小鼠足趾关节肿胀程度，计算各组小鼠不同时间的平均关节炎指数（mean arthritis index，MAI）；在免疫小鼠的第42天处死小鼠，制作病理切片检查各组小鼠关节受损以及淋巴细胞浸润的情况。通过流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析各组小鼠腘窝淋巴结中Th17细胞的比例，通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法检测各组小鼠血清中IL-17A的水平。 （3）G-exosomes和M-exosomes的免疫抑制功能检测 磁珠分选小鼠脾脏CD4+T细胞，抗CD3/CD28抗体刺激下增殖，在体系中加入一定浓度的G-exosomes和M-exosomes，以PBS和N-exosomes作为对照，用3H-胸腺嘧啶核苷（[3H]-thymidine,[3H]-TdR）掺入法检测CD4+T细胞的增殖水平，用ELISA检测培养上清IFN-γ的水平。磁珠分选初始T细胞（na?ve Tcell），建立诱导na?ve T细胞向Th17细胞分化的体系，在诱导体系中加入G-exosomes和M-exosomes，以PBS和N-exosomes作为对照，用FCM检测诱导分化体系中Th17细胞的比例,用ELISA检测培养上清IL-17A的水平。 （4）筛选G-exosomes中抑制Th17细胞分化的miRNA 对G-exosomes和M-exosomes中的miRNA进行测序分析，将G-exosomes和M-exosomes表达量前十位的miRNA以及两者差值的绝对值前二十位的miRNA作为待筛选miRNA，根据已有文献和靶标预测软件人工筛选出与RA、骨关节炎疾病、T细胞增殖、分化、免疫应答相关的miRNA作为候选miRNA；用qRT-PCR的方法检测G-exosomes处理后Th17诱导分化细胞中候选miRNA表达量的变化，选择倍数变化最大的前三位进行后续研究。转染前三位候选miRNA的mimics到na?ve T细胞，以转染mimics-negative control（mimics-NC）作为阴性对照，在Th17细胞诱导体系中培养，FCM检测各组Th17细胞的比例， ELISA检测培养上清中 IL-17A的水平，筛选出抑制Th17细胞分化的相关miRNA。转染相关miRNA的mimics或inhibitors到G-MDSC，提取过表达或阻断相关miRNA的G-exosomes，加入不同处理后的G-exosomes到Th17细胞诱导分化体系中，用FCM分析各组Th17细胞的比例，ELISA检测培养上清IL-17A的水平。 （5）G-exosomes携带的相关miRNA抑制CIA模型小鼠的发病 构建CIA小鼠模型，尾静脉注射过表达或阻断相关miRNA的G-exosomes。在小鼠模型发病过程中，记录小鼠足趾及关节活动情况，计算各组小鼠不同时间的MAI；在免疫小鼠的第42天处死小鼠，制作病理切片检查各组小鼠足趾关节受损以及淋巴细胞浸润的情况。FCM分析各组小鼠腘窝淋巴结中Th17细胞的比例，ELISA检测各组小鼠血清中IL-17A的水平，通过qRT-PCR检测各组CIA模型小鼠中引流淋巴结CD4+T细胞中相关miRNA的表达情况。 结果： （1）分选出G-MDSC和M-MDSC的纯度都在95%以上；从G-MDSC和M-MDSC的培养上清中提取到G-exosomes和M-exosomes；电镜结果显示两种exosomes为圆形或椭圆形微囊状结构，直径大多在30-100nm之间；两种exosomes表达CD9、CD63，不表达Calnexin蛋白。 （2）相对PBS组、N-exosomes对照组CIA小鼠，G-exosomes处理组小鼠足趾红肿不明显，活动较为正常，MAI水平明显降低，发病进程减缓，小鼠关节结构相对完整，关节间隙正常，淋巴细胞浸润较少；而M-exosomes处理组小鼠足趾肿胀，关节活动受限，MAI水平无明显变化，发病进程无明显变化，关节结构遭到破坏，关节间隙明显减小，淋巴细胞大量聚集。造模42天处死小鼠，G-exosomes处理组小鼠腘窝淋巴结中Th17细胞的比例以及血清IL-17A水平明显低于PBS、N-exosomes对照组，M-exosomes处理组则没有明显变化。 （3）在体外，G-exosomes或M-exosomes处理组的CD4+T细胞增殖水平以及IFN-γ分泌水平低于N-exosomes对照组。在体外，Th17细胞诱导分化的体系中，G-exosomes处理组的Th17细胞的比例以及IL-17A分泌水平低于N-exosomes对照组，但M-exosomes处理组则没有明显变化。 （4）我们根据测序结果以及相关文献和靶标预测软件筛选出miR-16-5p、miR-29a-3p、miR-93-5p、miR-22-3p、miR-26b-5p、Let-7f-5p、Let7g-5p、miR-221-3p、miR-92a-3p作为候选 miRNA。其中 miR-16-5p、miR-29a-3p和 miR-93-5p在G-exosomes处理后Th17诱导分化细胞中表达量的倍数变化最大。相对于转染mimics-NC对照组，转染miR-93-5p-mimics处理组诱导体系中Th17细胞的比例以及IL-17A分泌水平明显降低；而转染miR-16-5p-mimics和miR-29a-3p-mimics处理组则无明显变化。过表达miR-93-5p的G-exosomes明显抑制了诱导分化体系中Th17细胞的比例以及IL-17A的分泌，而阻断表达miR-93-5p的G-exosomes则无法明显抑制诱导分化体系中Th17细胞比例以及IL-17A的分泌。 （5）过表达miR-93-5p的G-exosomes处理组CIA小鼠足趾红肿不明显，活动较为正常，MAI水平降低，发病进程减缓，关节结构相对完整，关节间隙正常，淋巴细胞浸润较少。阻断表达miR-93-5p的G-exosomes处理组小鼠足趾肿胀，关节活动受限，MAI水平增高，发病进程加快，关节结构遭到破坏，关节间隙明显减小，淋巴细胞大量聚集。我们发现过表达miR-93-5p的G-exosomes处理组小鼠引流淋巴结中CD4+T细胞miR-93-5p的表达量明显升高，阻断表达miR-93-5p的G-exosomes处理组miR-93-5p的表达量则明显降低；同时过表达miR-93-5p的G-exosomes处理组小鼠腘窝淋巴结中Th17细胞的比例和外周血IL-17A的水平明显降低，而阻断表达miR-93-5p的G-exosomes处理组小鼠的Th17细胞的比例和外周血IL-17A的水平明显增高。 结论： （1）成功制备G-exosomes和M-exosomes，其中G-exosomes能够有效抑制CIA小鼠的发病；G-exosomes体外抑制CD4+T细胞的增殖和Th17细胞的分化。 （2）G-exosomes携带的miR-93-5p体外抑制Th17细胞的分化；G-exosomes携带的miR-93-5P可通过降低Th17细胞的比例有效减缓CIA小鼠的疾病严重程度。