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抑郁症是一类以持久的心境低落和认知功能障碍为主要临床特征的神经精神疾病,严重危害着人类的身心健康。抑郁症与单胺神经递质系统的功能障碍有关,导致细胞外单胺水平的降低和单胺神经传递的减慢。脑部的单胺传递依赖于uptake 1和uptake2转运体系统,维持着细胞内液和细胞外液中神经递质的平衡。目前常用的抗抑郁药大多以uptake 1转运体为靶点,通过抑制其对单胺的重摄取,发挥抗抑郁作用。近年来新发现的uptake 2转运体作为uptake 1转运体的补充,可以在某些不表达uptake 1转运体或者当uptake 1转运体功能被抑制时负责清除胞外的单胺。推测uptake 2转运体也可能作为抗抑郁治疗的靶点。延胡索生物碱是中药延胡索的主要活性成分之一。据文献报道,延胡索提取物可以提高脑内单胺神经递质的含量,具有潜在的抗抑郁作用,但是关于其抗抑郁的机制研究还很少。本课题组前期研究发现延胡索生物碱对uptake 2转运体具有不同程度的抑制作用,其中去氢延胡索甲素(DHC)对于uptake 2体系的转运体抑制作用较强,IC50值在0.1～4 μM之间。因此推测DHC可能是延胡索产生抗抑郁作用的主要成分之一。本文首先利用转基因细胞模型考察延胡索生物碱是否为uptake 1转运体的抑制剂,结合前期的研究,确证DHC是uptake 2转运体的专属性抑制剂。接着采用行为绝望模型和慢性不可预见性慢性应激模型,对DHC的抗抑郁作用进行验证,论证了 uptake2转运体抑制剂在抗抑郁治疗中的作用。最后结合抑郁症发病机制,从神经递质、单胺氧化酶抑制剂、HPA轴等方面,进一步对其可能的抗抑郁作用机制进行探讨。1.Uptake 1转运体细胞模型的构建本章旨在构建稳定表达hDAT/hSERT的MDCK转基因细胞模型并应用于潜在抑制剂的考察。首先,通过脂质体法将验证正确的含有hDAT/hSERT的pcDNA3.1(+)质粒转染MDCK细胞,经G418抗性筛选获得单克隆细胞。接着通过摄取功能验证并结合mRNA表达水平,获得稳定高表达的MDCK-hDAT/hSERT细胞。最后运用构建的细胞模型考察去氢延胡索甲素等12种延胡索生物碱单体对其摄取单胺能力的影响。结果表明,本研究构建的MDCK-hDAT/hSERT细胞模型对其经典底物多巴胺/五羟色胺的积聚量是mock细胞的100/40倍以上,经典抑制剂GBR12909/氟西汀可使其积聚量显著降低,MDCK-hDAT/hSERT细胞的mRNA表达是mock细胞的5093/1308倍,这表明MDCK-hDAT/hSERT细胞模型构建成功,可用于后续研究。高浓度(100 μmol/L)的延胡索生物碱均不能抑制MDCK-hDAT/hSERT细胞对其经典底物的摄取,说明延胡索生物碱不是uptake 1转运体的抑制剂。2.延胡索提取物及去氢延胡索甲素对抑郁模型小鼠的影响本章采用行为绝望模型和慢性不可预见性温和应激模型,考察延胡索提取物及去氢延胡索甲素的抗抑郁作用。首先应用小鼠悬尾实验验证延胡索提取物的抗抑郁能力,接着应用行为绝望模型初步评价DHC的抗抑郁作用,并对其量效关系进行考察,然后建立慢性不可预见性温和应激模型(CUMS),对DHC的抗抑郁作用进行确证。结果显示,延胡索浸膏(50 mg/kg)可以显著缩短小鼠悬尾实验中的累计不动时间,与文拉法辛(10 mg/kg)合用能进一步缩短不动时间,证明了延胡索的抗抑郁作用。中高剂量的DHC(1.5 mg/kg,3 mg/kg)在小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中均能显著缩短累计不动时间,提示DHC对行为绝望模型小鼠具有抗抑郁作用。CUMS造模导致小鼠糖水偏好率降低,自主活动能力下降以及强迫游泳不动时间延长,中剂量的DHC(1.5 mg/kg)逆转了 CUMS引起的小鼠自主活动能力减弱,强迫游泳不动时间延长;高剂量的DHC(3 mg/kg)逆转了 CUMS引起的小鼠糖水偏好率降低,强迫游泳不动时间延长。上述结果说明DHC对CUMS抑郁模型小鼠具有抗抑郁作用。3.DHC抗抑郁作用的可能机制研究本章从神经递质、单胺氧化酶抑制剂、HPA轴等方面对DHC的抗抑郁作用机制进行探讨。采用LC-MS/MS方法测定CUMS小鼠前额叶处单胺递质及其代谢物的含量变化情况,考察DHC抗抑郁作用与脑部单胺稳态之间的关系;采用与底物共孵育的方法考察DHC对MAO-A的抑制作用,以阐明DHC抗抑郁作用与单胺氧化酶活性抑制之间的关系;测定CUMS小鼠血浆中皮质酮含量的变化情况,考察DHC抗抑郁作用与调节HPA轴功能之间的关系。结果显示,CUMS刺激导致小鼠前额叶处单胺神经递质(5-HT,NE)含量降低,同时单胺流通率(5-HIAA/5-HT,MHPG/NE)增加,高剂量的DHC(3 mg/kg)可以增加CUMS小鼠前额叶的5-HT,NE含量,同时减慢单胺流通率,说明DHC抗抑郁作用的发挥与其对单胺神经递质的调节有关。100 μmol/L的DHC不能抑制MAO-A对5-HT的酶解作用,说明DHC对脑部单胺神经递质的调节作用与抑制MAO无关。CUMS导致小鼠血浆皮质酮含量增加,给予DHC后,血浆中皮质酮含量显著降低,说明DHC可能通过调节HPA轴功能发挥抗抑郁作用。综上所述,DHC抗抑郁作用机制可能与抑制uptake 2转运体维持脑部神经递质稳态以及调节HPA轴功能有关。