随着测序技术以及大数据信息科学的发展,越来越多导致疾病的基因突变已经被发现。不仅如此,如今的技术已经可以预测一些疾病的发生可能与基因组上哪些DNA突变相关。然而,需要验证预测的结果,或是对已经发生的基因突变进行治疗,就必须依靠基因编辑技术。传统的基因改造技术以基因打靶或是化学诱变(如乙烷亚硝基脲)为主。前者依赖于胚胎干细胞自发性同源重组反应,而后者通过诱导随机性的突变进而再筛选出需要的突变。两者都需要投入相当的时间和精力,况且有些物种还没有完整的胚胎干细胞培养体系,难以在日常的研究中广泛使用。近十年来,ZFN和TALEN人工核酸酶的出现改变了整个基因编辑领域过去的面貌。相对传统的基因打靶技术,ZFN和TALEN能够快速地引起双链DNA的断链,而这种DNA损伤既能够大大提高细胞内自发同源重组发生的概率,也能够简单地敲除某一基因。通过向胚胎注射能结合目的序列的ZFN或TALEN的mRNA,人们曾突破性地成功在大鼠体内实现了定点基因编辑。然而ZFN的特异有时受到相邻模块的影响,TALEN的DNA结合域存在大量的重复序列,给载体的构建带来相当的难度。就在TALEN技术出现后不久CRISPR/Cas技术的出现很好地解决了这些问题。CRISPR/Cas系统的核心由Cas9蛋白以及单链引导RNA (sgRNA)组成。前者扮演核酸酶的作用,后者则负责引导Cas9蛋白与靶序列的结合。CRISPR/Cas系统要发挥功能必须满足两个条件：1. sgRNA与靶点DNA序列按照碱基互补原则配对；2.在与sgRNA配对的靶序列3’端必须紧跟PAM序列。由于CRISPR/Cas系统靶向新的靶点只需要合成新的sgRNA,相较于ZFN和TALEN更为灵活,且操作简便,效率更高,所以很快在基因编辑领域发展开来。目前,通过CRISPR/Cas技术已经成功在猴、猪、斑马鱼、果蝇、拟南芥等经典模式动植物中实现了基因编辑。我们实验室也最早报导了利用该技术构建基因修饰小鼠和大鼠的研究。在主流的动物敲除模型构建中主要通过向胚胎注射表达Cas9的mRNA(或DNA)以及sgRNA来实现基因敲除。直接向胚胎注射Cas9重组蛋白以及sgRNA来实现基因编辑的报道还非常少。现有的技术中,往往只是通过简单地在受精卵中引入DNA缺失来达到敲除的目的,大片段DNA的删除或者插入也只能通过胚胎干细胞来进行操作,还必须经过较长的阳性筛选才能得到克隆。至今还没有直接在动物胚胎中通过基因编辑的方法对大片段DNA进行缺失或插入的报道。在本篇论文中,我们通过体外表达具有DNA内切酶活性的Cas9重组蛋白并将其与sgRNA混合后共同注射到小鼠或大鼠的受精卵中实现了体内基因的敲除。通过在注射体系中加入单链寡核苷酸供体(ssODN)我们成功构建了小鼠Sinl和F9基因的点突变模型。通过脱靶检测我们发现注射Cas9蛋白来实现基因编辑较之注射mRNA在脱靶率上有一定程度的降低。越来越多的研究发现长片段非编码RNA在体内基因的调控、染色体的高级结构以及DNA表观修饰中起着重要的作用,为了研究CRISPR/Cas技术在小鼠或大鼠体内对大片段DNA的敲除能力,我们利用“双sgRNA切割”策略成功地敲除了小鼠体内长达53kb的IncRNA GM14005以及长达95kb的Fpr1,Fpr2,Fpr3基因簇。为快速建立大片段DNA缺失的小鼠模型提供了手段。“细胞代系追踪”是研究干细胞分化、发育以及肿瘤型成的重要工具。然而现有的报导中还缺少利用CRISPR/Cas技术来加快“细胞代系追踪”模型构建的方法。我们通过向小鼠Nfatc1基因座第9号外显子敲入IRES-Cre-ERT2-polyA成功构建了可诱导Cre入核的工具小鼠。通过将Nfatcl-CreER+/小鼠与Rosa26-lsl-LacZ-/-小鼠杂交得到Nfatc1-CreER+/-,Rosa26-lsl-LacZ+/-小鼠后注射Tamoxifen(坦莫西芬)诱导,我们成功构建了小鼠细胞“代系追踪”模型,并追踪了表达Nfatc1的皮肤毛囊干细胞和其子代细胞。条件敲除模型在研究一些全敲致死的基因中扮演着重要的作用,通过向大鼠Lgr5基因座1号内含子敲入倒置“基因盒”SA-GFP-polyA,我们成功构建了Lgr5报告基因条件敲除的大鼠。这是首次在大鼠品系中报道构建条件敲除的模型。并且我们结合Cre诱导的“DNA倒序”技术,在Lgr5条件敲除大鼠的肠隐窝中成功地标记了Lgr5基因敲除的细胞,实现了“嵌合分析”模型。利用“嵌合分析”模型可以清楚地将被敲除的细胞可视化,结合条件敲除技术,有利于从时空层面研究各种基因的重要功能。综合我们的实验结果,我们发现通过向胚胎直接注射Cas9重组蛋白以及sgRNA可以高效地实现各种基因编辑,包括点突变、大片段DNA的敲除、敲入。并且这些基因编辑都能够高效地整合入小鼠、大鼠的生殖系细胞遗传给子代。