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胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell）系是从早期胚胎细胞分离培养而建立的高度未分化的具有全能性的细胞系。在体外，ES细胞可自发分化为含有内胚层、中胚层、外胚层来源的多种组织和细胞的拟胚体。如何促进ES细胞向造血细胞定向分化是血液界学者关注的热点。目前，诱导ES细胞向造血细胞分化主要应用小鼠成纤维细胞系（如OP9、MS-5、RPO．10、ST2、NIH-3T3、PA6等）与ES细胞共培养的方法。本课题探讨利用骨髓内皮细胞条件培养液（mBMEC-CM）诱导小鼠ES细胞向造血细胞分化，以消除外源性细胞污染，为诱导人ES细胞生成造血细胞提供实验基础。在诱导小鼠ES细胞向造血细胞分化的实验中，我们采用先将小鼠胚胎干细胞形成4天拟胚体（day 4 embryoid bodies，4dEBs），再用骨髓内皮细胞条件培养液诱导4天拟胚体细胞生成造血干／祖细胞。实验根据造血集落的形成、造血干／祖细胞特异抗原和造血相关基因表达等方面检测诱导生成的细胞是否含造血干／祖细胞以及生成造血干／祖细胞的数量，并且检测诱导生成细胞的造血重建功能。实验还探讨了骨髓内皮细胞条件培养液联用细胞因子或胎肝基质细胞条件培养液能否加强其诱导效果。主要结果如下： 一、胚胎干细胞鉴定以及形成拟胚体的影响因素 实验前对ES-D3细胞的生物学特性进行鉴定，包括对生长和未分化状态、体内外分化潜能、嵌合能力、染色体核型等特性进行检测。结果显示：ESo3细胞在小鼠胚胎成纤维细胞上和／或含白血病抑制因于亿F)的ES细胞培养液中形成典型的胚胎干细胞克隆，碱性磷酸酶染色结果为强阳性，具有正常二倍体核型以及具有在体内外分化为三个胚层来源的组织细胞的潜能，而且具有形成种系嵌合动物的能力。以上实验说明拟采用的ESo3细胞株保持未分化状态，具有全能性。 以 5 X 10’加 的 ESo3细胞种入含 20％胎牛血清和 ZInM谷氨酚胺的高糖DMEM中，观察进口胎牛血清和国产胎牛血清、饲养层、培养器皿以及卜硫基乙醇对ES士3细胞形成的4dEBs数量的影响。结果表明：ESo3细胞在含有LIF的培养液中脱离饲养层培养3代以上才能形成EBs。在含进口 Hyclone胎牛血清或国产四季青胎牛血清的培养液中培养，ES－D3细胞形成的 4dEBs数量分另为 44．83if．22个／ml （n＝6）和 43．17士1．05个／。1（n＝6），差异无统计学意义（NO．05）。在不含p－颈基乙醇（P仇E“）或含p－ME的培养液中培养，ESo3细胞形成的4d朋s数量分另为49．33if．76个／ml（n书）和273．50士4．06个／ml（n二6），H者比较差异有统计学意义（HO．001）。在铺有粘附物质的细胞培养皿中培养，ES干3细胞不形成 EBS；在玻璃培养瓶中培养，ES－D3细胞形成的 4dEBs数量为 47．33士 1．48个／＊1（n＝6）；在Petri细菌培养M中培养，ES刁3细胞形成的4dEBs数量为310．83士 2．92个加1＊乃人三者两两比较差异均有统计学意义u值均为HO．00人说明 ES03细胞脱离饲养层培养三代后，在含国产四季青胎牛血清的培养液中加入 p仇E，置于 Pe t r i细菌培养皿中培养拟胚体，能提高拟胚体的形成数量。二、InBMEC－CM诱导小鼠ES细胞生成造血干／祖细胞 将获得的4dEBS制成单细胞悬液，加入InBMEC－CM诱导4dEBS的单细胞生成造血干／祖细胞。实验根据造血集落的形成、造血干／祖细胞特异抗原和造血相关基因表达等方面检测诱导生成的细胞是否含造血干／祖细胞以及生成造血于／祖细胞的数量。实验还探讨了骨髓内皮细胞条件培养液联用细胞因子或胎肝基质细胞条件培养液能否加强其诱导效果。 造血集落形成能力的检测结果显示：InBMEC六M诱导4dEBS的单细胞生成的细胞能形成mP六FC和 BFU士两种造血集落，具备小鼠骨髓细胞形成的这两种造血集落特征。诱导生成的细胞在HPP｛FC培养体系中形成的集落细胞，瑞氏－吉姆萨染色的结果中可观察到环状核的中幼粒细胞、杆状核和分叶核的粒细胞以及肾形核的单核细胞。同时免疫细胞化学染色结果显示，该集落大部分细胞表达CDI fo抗原．H鼠巨噬细胞、粒细胞、激活的淋巴细胞和NK细胞均有表达人 以上说明诱导生成的细胞能形成代表早期造血细胞的HPP六FC集落。诱导生成的细胞在BFU士培养体系中形成的集落细胞，联苯胺染色的结果显示，集落细胞的胞浆呈黄褐色，为阳性反应。该集落大部分细胞表达小鼠红系特异抗原 （TEd 人同时这些细胞表达胚胎型（p十）和成体型（p－major）珠蛋白基因。以上说明诱导生成的细胞能形成代表早期红系祖细胞的 BFU士集落。 以形成造血集落＊PP＜FC和 BFU中）的数量为检测指标，观察InBMEC七M诱导生成的细胞数与其形成的造血集落数之间的关系，并且观察InBMEC六M的适宜诱导浓度和诱导天数。结果显示：种入的由帕皿卜枷诱导生成的细胞数（在卜4X m‘个／M范围内）与形成的HPP—CFC禾 BFU—E集落数之间均呈良好的线性关系（HPP－CFC，r＝0．gi 6，HO．05；BFU－E，r＝0．927，RO．05）。InBMEC－CM诱导浓度（在 0－20％范围内）与其诱导生成的细胞形成的造血集?