第一部分输精管梗阻性无精子症小鼠模型的构建和精子RNA提取方法的优化【目的】构建理想的输精管梗阻性无精子症小鼠模型,优化精子RNA的提取方法,解决本研究的模型和关键技术问题,为后续实验奠定基础。【方法】(1)6周龄的正常雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组(双侧输精管梗阻)和对照组(假手术)。实验组小鼠麻醉后,于双侧输精管近端行缝线结扎,于结扎点远端离断输精管,且近端的断端行烧烙闭合。对照组小鼠处理同上,但不行输精管结扎、离断及烧烙。(2)分别于术后4周、8周、12周,分离小鼠的睾丸和附睾,观察并称量睾丸和附睾的重量,行HE染色以观察组织形态。(3)分离各组小鼠附睾尾部精子,分析精子总量、前向运动率,行伊红染色检测精子存活率、Diff-Quik染色法检测精子畸形率。(4)两组雄鼠与雌鼠合笼,次日对阴栓阳性的雌鼠采用生理盐水冲洗法行阴道涂片,镜检判断是否有精子。阴栓阳性雌鼠于交配后21天解剖,判断妊娠情况。(5)分别用Triziol和DTT裂解液裂解精子,涂片后镜检,评估裂解效果。(6)单用体细胞裂解液(Somatic Cell Lysis Buffer,SCLB)和细胞筛联合SCLB预处理精子,提取总RNA用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增c-Kit、CD4和Cadherin,分别判断生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。(7)分别采用Trizol和Trizol LS抽提DTT裂解液中的精子RNA,测量并比较两种方式提取的RNA纯度和总量。(8)构建包含以下关键技术的精子RNA提取体系:细胞筛联合SCLB预处理精子、DTT裂解液裂解精子、Trizol LS抽提DTT裂解液中的RNA。用Agilent 2100分析采用上述方法提取的精子RNA的长度分布和完整性,包括绘制模拟琼脂糖凝胶电泳图和长度分布峰图,并计算RIN值。【结果】(1)对6周龄雄性C57BL/6小鼠行双侧输精管近端结扎8周,可构建符合临床特征的梗阻性无精子症小鼠模型。表现为:射出的精液中未检出精子;不育,交配后雌鼠妊娠率为0(p<0.001);附睾明显肥大肿胀,重量增加(附睾重量/体重为0.39%vs 0.31%,p<0.001);附睾内精子淤滞,附睾尾部精子的浓度(11.50 vs 8.17×107,p<0.001)和畸形率显著增加(17.50%vs 65.00%,p<0.001),存活率(16.67%vs 60.83%,p<0.001)和活力(18.83%vs 65.00%,p<0.001)显著降低;睾丸大小、硬度、光滑度及重量(0.67 vs 0.66 g,p>0.05)均无明显差异;生精小管结构无明显异常。(2)Trizol裂解精子后,镜检见大量完整的精子;而DTT裂解液能完全裂解精子,镜检未见残留精子或精子碎片。(3)对于单用SCLB预处理的精子,琼脂糖凝胶电泳示c-Kit、CD4阴性,而Cadherin阳性,提示存在附睾上皮细胞的污染。细胞筛联合SCLB预处理精子后,c-Kit、CD4和Cadherin均阴性。(4)DTT裂解精子后,用Trizol LS抽提的精子RNA总量平均1.41±0.06mg/107精子,显著高于Trizol(0.59±0.04mg/107精子,p<0.001),约为后者RNA提取量的2.5倍。(5)采用本研究的方法提取的精子RNA,表现为以分子量低于100 nt的小RNA为主要种类;无明显28S、18S r RNA条带;不完整性(RIN<7):符合精子RNA特征。【结论】(1)对6周龄雄性C57BL/6小鼠行双侧输精管近端结扎8周,可构建符合临床特征的梗阻性无精子症小鼠模型。(2)本研究建立了高效可靠的精子总RNA提取体系,关键技术包括DTT裂解液裂解精子、细胞筛联合SCLB去除体细胞污染、Trizol LS抽提DTT裂解液中的RNA。采用该方法提取的精子RNA纯度高,总量大且符合精子RNA特征。第二部分输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子mi RNA和ts RNA表达谱的变化【目的】研究输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子mi RNAs和ts RNAs表达谱的变化。【方法】(1)利用二代测序技术检测并比较了假手术组(Shame Operation,SO)和输精管梗阻性无精子症组(Obstructive Azoospermia,OA)的小鼠附睾尾部精子mi RNAs和ts RNAs的表达水平。(2)选取部分差异表达的小RNAs,同时在同批样品及同类型样品中采用q PCR验证测序结果。【结果】(1)c DNA文库对应的原始序列长度为14-40 nt,为小RNAs的长度范围,92%以上的碱基的正确准确率高达99.9%。(2)生理情况下,精子中超过50%的小RNAs为ts RNAs,但在OA小鼠中,这一比例有下降趋势。无论在SO还是OA小鼠,t RF-5s均为附睾尾部精子中最主要的ts RNA类型,占比超过了50%。(3)与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾部精子共288个mi RNAs呈现差异表达,其中上调的mi RNAs为108个,下调的mi RNAs为180个。下调的mi RNAs集中于3个mi RNA簇——mi R-17~92、Sfmbt2 mi RNA、spermi R。(4)与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾部精子共91个ts RNAs呈现差异表达,其中包括了多种可能影响早期胚胎发育和子代健康的ts RNAs。GO富集分析也表明这些差异表达的ts RNAs分子参与了多种生物学过程的调控。(5)q PCR验证结果中绝大部分选取的小RNAs的差异表达与测序的差异表达趋势一致,仅极少数mi RNAs与测序的差异表达趋势相反。【结论】输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子中多种mi RNAs和ts RNAs表达水平发生了变化第三部分输精管梗阻性无精子症小鼠附睾尾部精子小RNAs异常表达的机制初探【目的】分析附睾尾部组织、附睾小体及精子中ts RNAs和mi RNAs的差异表达的相关性。分析与附睾小体共孵育后,精子ts RNAs和mi RNAs的水平变化。分析OA小鼠的附睾组织中t RNA修饰相关酶、ts RNA合成酶及mi RNA合成酶表达水平的变化,从而初步探索OA小鼠附睾尾部精子中ts RNAs和mi RNAs异常表达的机制。【方法】(1)BSA连续密度梯度单位重力沉降法分离睾丸中不同阶段生精细胞后,采用q RT-PCR检测并比较不同阶段生精细胞中指标ts RNAs和mi RNAs分子的表达水平,以分析指标分子在不同阶段生精细胞中表达的动态趋势。比较SO组和OA组小鼠同阶段生精细胞中指标ts RNAs和mi RNAs的表达水平,以明确差异表达产生的阶段。(2)差速离心法分离附睾尾部的附睾小体后,q RT-PCR检测并比较SO组和OA组小鼠的附睾尾部组织、附睾小体中指标ts RNAs和mi RNAs分子的表达水平,与精子中的差异表达作比较,并分析相关性。(3)差速离心法分离附睾头部和尾部的附睾小体,q RT-PCR分别检测附睾小体和对应部位精子中指标ts RNAs和mi RNAs的表达水平,并分析相关性。(4)将附睾头部精子与附睾尾部附睾小体进行体外共孵育,并分析孵育后精子ts RNAs和mi RNAs的水平变化。(5)采用q RT-PCR和Western Blot同时从转录和蛋白水平分析了小鼠附睾组织中多种t RNA修饰酶的表达,包括t RNA甲基化转移酶DNMT2、NSUN2、FTSJ1,t RNA甲硫基转移酶CADKAL1,t RNA次黄嘌呤修饰酶ADAT2,t RNA去甲基化酶ALK和t RNA假尿苷修饰酶PUS1,以及ts RNA合成酶Angiogenin以及mi RNA合成酶Drosha、Dicer的转录水平。【结果】(1)与SO小鼠相比,OA小鼠睾生精细胞中t RF-Val-CAC-012、t RF-Gly-GCC-016、t RF-Ser-AGA-006、mi R-149-3p、mi R-370-3p、mi R-34b-3p的表达水平均无显著差异(全部p>0.05)。而mi R-16-5p在睾丸中表现为显著上调(p<0.05),与附睾尾部精子的差异表达趋势相反(p<0.05)。而t RF-Gly-GCC-016、t RF-Ser-AGA-006和mi R-149-3p在OA小鼠的附睾头部和尾部精子均显著上调(全部p<0.05,mi R-34b-3p均显著下调(两者p<0.01)。t RF-t RF-Val-CAC-012在附睾头部精子中无显著差异(p>0.05),在附睾尾部精子中显著下调(p<0.05)。mi R-370-3p在附睾头部精子中无显著差异(p>0.05),在附睾尾部精子中显著上调(p<0.01)。(2)与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾组织和附睾小体中mi R-34b-3p和t RF-Val-CAC-012显著下调(所有p<0.01),而mi R-149-3p(p<0.01)和t RF-Gly-GCC-016(p<0.05)显著上调,与附睾尾部精子的差异表达趋势一致。(3)相关分析表明,附睾尾部组织与附睾小体中小RNAs的差异表达高度正相关(r=0.84,p<0.001)。同时附睾尾部小体与精子中小RNAs差异表达高度正相关(r=0.83,p<0.001)。(4)无论在SO还是OA小鼠中,附睾小体的t RF-Gly-GCC-016、t RF-Val-CAC-012、mi R-34b-3p、mi R-149-3p表达水平与精子中的表达水平高度正相关(SO组依次r=0.60,p<0.05;r=0.84,p<0.05;r=0.81,p<0.01;r=0.73,p<0.01;OA组依次r=0.60,p<0.05;r=0.67,p<0.05;r=0.61,p<0.05;r=0.83,p<0.01)。(5)分别与SO组和OA组的附睾小体共孵育后,精子中mi R-149-3p和t RF-Gly-GCC-016的表达水平呈现与附睾小体一致的差异表达(p<0.01)。(6)与SO小鼠相比,OA小鼠的附睾组织中Dnmt2、Cdkal1、Ftsj1转录水平降低,Nsun2转录水平增加,ts RNA合成酶Angiogenin和mi RNA合成酶Dicer的转录水平均无显著差异,但Drosha转录水平上调。Western Blot结果表明,CADKAL1和NSUN2蛋白的表达变化与m RNA一致。【结论】OA可导致小鼠附睾组织中多种mi RNAs和ts RNAs表达水平的变化,并通过附睾小体传递到精子,最终导致精子中多种mi RNAs和ts RNAs异常表达。而OA小鼠附睾组织中多种小RNAs的异常表达,可能与其附睾组织中t RNA修饰酶NSUN2和CADKAL以及mi RNA合成酶Drosha的异常表达相关。