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烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性土传病害,在连作酸性土壤中为害加重、防治困难。生物防治可以减少化学药剂施用,应用前景广阔。目前,针对酸性土壤中烟草青枯病生物防治研究甚少,因此利用耐酸性生防细菌防治酸性土壤中的烟草青枯病是非常必要的。本研究在酸性条件下筛选和鉴定一株拮抗烟草青枯菌的耐酸性细菌CLP6,通过研究抑菌物质、根际定殖力和对土壤肥力的影响初步探明防病机理,通过室内和大田试验明确其防病促生效果,主要研究结果如下:1.从湖南省张家界市慈利县烟草青枯病发生重的酸化烟田健株根际土壤中筛选到一株对青枯菌具有良好拮抗活性的耐酸性细菌CLP6,其生长繁殖和拮抗活性在pH 5.5条件最好;透射电镜观察到CLP6上清液能破坏青枯菌菌体细胞进而抑制细菌生长;实时荧光定量PCR结果显示,CLP6能够显著减少酸性土壤中和烟草茎内青枯菌数量。结合BIOLOG GENⅢ和16S rDNA基因序列分析将其鉴定为护卫假单胞菌(Pseudomonas protegens)。2.菌株CLP6能分泌蛋白酶、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和挥发性有机化合物(VOCs)。超声破碎和硫酸铵沉淀提取到的胞内、外蛋白粗酶液对青枯菌均具有拮抗活性。高效液相色谱质谱联用技术证明CLP6只在pH 5.5条件分泌2,4-DAPG,产量为30μg·L-1,对青枯菌抑菌圈直径为9 mm。CLP6分泌具有广谱抑菌范围的VOCs,其拮抗活性与接种浓度、接种量以及熏蒸时间正相关。通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱检测技术明确VOCs含有九种组分:硫代醋酸S-甲酯、硫氰酸甲酯、二甲基二硫醚、1-十烯、2-乙基己醇、1,4-十一二烯、1-十一烯、苯并噻唑、2,5-二甲基吡嗪。pH 5.5条件下,VOCs中硫代醋酸S-甲酯、1-十烯、1,4-十一二烯、1-十一烯和2-乙基己醇的含量高于pH 7.0条件,且硫代醋酸S-甲酯只在pH 5.5条件下产生。苯并噻唑和2-乙基己醇对青枯菌抑制率为100%,硫氰酸甲酯和二甲基二硫醚抑制率为88.91%和67.64%;硫代醋酸S-甲酯、2,5-二甲基吡嗪抑菌率分别为53.29%和43.98%,1-十烯、1-十一烯和1,4-十一二烯的拮抗活性差。3.菌株CLP6能定殖于烟草根尖表皮,且能提高土壤肥力。通过绿色荧光蛋白标记技术获得标记菌株CLP6-GFP,其生长速率和拮抗活性未变;激光共聚焦显微镜观察到CLP6在烟草根尖表皮细胞定殖;CLP6能够提高土壤磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性,其酶活性分别在施菌后60、60和20 d时最高;增加土壤养分含量,其中,施菌后20 d时,土壤速效磷、硝态氮和有机质含量最高,40 d时铵态氮含量最高,60 d时速效钾含量最高。4.室内和大田试验证明菌CLP6对烟草青枯病防效较好,并促进烟草营养生长。盆栽试验结果表明,CLP6处理和多粘类芽孢杆菌在酸性土壤中防效分别为78.66%和74.01%,中性土壤中防效分别为72.61%和76.99%。大田防病试验结果显示,施菌后60 d,烟草青枯病防效为69.49%。CLP6能提高烟草生物量积累,包括增加烟株株高、整株鲜重、根干重及有效叶数和最大单位叶面积,其中整株干重和株高增加明显,增长率分别为70.15%和74.24%。