背景:脑卒中是全球最常见的致死原因之一。由于其发病快、并发症多、时间窗窄等原因,截至目前针对缺血性卒中的有效治疗方案仍有限。因此,针对脑卒中过程中脑微环境的调节,以及卒中后神经、组织损伤修复的治疗方案显得尤为重要。小胶质细胞是常驻于中枢神经系统的免疫细胞,可响应中枢神经系统微环境变化而改变其表型,发挥促炎或抗炎作用,影响缺血性卒中的预后。有研究表明,小胶质细胞的过度激活有助于神经退行性过程,这些过程由促炎细胞因子和一氧化氮等各种神经毒性因子的产生所导致。激活素A（Activin A,Act A）作为TGF-β超家族的成员在调节免疫反应中起关键作用。近年研究显示,Act A/Smads信号通路在神经系统损伤修复过程中起着重要的作用,课题组前期对Act A的神经保护作用也进行了系列研究,认为它可保护神经元免受缺血缺氧损伤,并证实Act A/Smads信号通路是一个自限性正反馈环路,可放大Act A的神经保护作用。但其可否影响小胶质细胞极化方向及其作用机制尚不清楚。此外,作为活跃的高度动态的细胞器,线粒体能够通过裂变或融合来改变它们的形状和分布,以应对生理或代谢条件,实现细胞内和机体内的能量需求,维持机体平衡,这个过程叫线粒体动力学。其对于确定线粒体的形态和体积以使其立即适应细胞能量需求至关重要,机体多种系统发挥正常功能都有赖于其动力学的平衡。已有研究表示缺氧损伤中线粒体动力学参与了小胶质细胞因子的表达过程,分裂蛋白的表达增加可诱导小胶质细胞促炎极化,推测线粒体融合、分裂的失衡会对小胶质细胞产生严重影响,控制融合分裂维持动态平衡可能对小胶质细胞的表型极化有重要意义。然而,小胶质细胞极化中的线粒体动力学发挥的功能作用仍未知。本研究通过对小胶质细胞建立体外氧糖剥夺模型以模拟体内缺血过程,探讨Act A/Smads信号通路在脑缺血损伤中通过调节线粒体融合蛋白对小胶质细胞极化行为起调控作用的机制及其对神经细胞产生的作用,为急性缺血性卒中提供新治疗思路和靶点。方法:1.采用CCK-8测细胞活力、流式细胞术测凋亡检测BV2细胞OGD模型的建立是否成功;采用ELISA和Western Blot对小胶质细胞M1、M2标志物进行检测,以及对通路变化的影响。2.采用Transwell小室建立小胶质细胞-神经元共培养体系,采用CCK-8、流式细胞术、MDA、ROS、Western Blot检测小胶质细胞-神经元共培养体系的建立及对体系凋亡、铁死亡GPX4、x CT、NRF2蛋白的影响。3.给予外源性Act A和转染小干扰RNA对Smad2进行敲降,用Western Blot检测干预效果以及通路活性变化,采用Western Blot、CCK-8、流式细胞术、ELISA、Western Blot、MDA、ROS检测Act A/Smad2通路活性对BV2及共培养体系的影响。4.Western Blot检测OGD损伤对线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1表达的影响,以及Act A/Smads通路差异活性对OGD损伤中Mfn1、Mfn2、Opa1表达产生的影响。5.对BV2转染小干扰RNA对Mfn2进行基因敲低,Western Blot、CCK-8、流式细胞术、ELISA、Western Blot、MDA、ROS检测Mfn2的si-RNA转染对BV2及共培养体系的凋亡、铁死亡的影响。6.利用生信工具gepia2、免疫荧光染色、双荧光素酶报告基因检测、q PCR探究Smad2和Mfn2的联系,进一步确定Mfn2是否为Act A/Smads通路在OGD损伤中调控小胶质细胞极化方向的机制。结果:1.随着OGD时间的延长,BV2活力逐渐降低,细胞凋亡增加,BV2的M1标志物呈时间依赖性逐渐升高,而M2标志物呈现先升高后下降的趋势,且与通路标志物的表达一致,表明缺氧早期细胞Act A/Smads通路呈现短时程的保护机制以对抗缺氧损伤,但缺氧造成的损伤程度仍然随时间加剧。这种表现体现在共培养体系中PC12细胞活力逐渐降低和凋亡增加,MDA、ROS水平随OGD时间升高,铁死亡抑制蛋白表达降低。2.CCK-8、流式细胞术检测给予外源性Act A后BV2细胞受OGD的凋亡损伤减低,细胞活力回升,Western Blot检测Act A干预促进了小胶质细胞M2型极化;敲降BV2细胞的Smad2则加剧了缺氧损伤,体现在M1标志物表达增加和M2表达降低,以及BV2的凋亡水平增加。共培养体系Western Blot、MDA、ROS、cck-8和流式的结果进一步验证了上述结果,即缺氧损伤中Act A/Smads通路活性通过调控小胶质细胞极化表型对神经细胞起保护作用。3.OGD损伤中,Mfn1、Mfn2、Opa1表达与Act A/Smads通路关键标志物的表达正相关,外源性Act A的给予可增加BV2细胞中融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1的表达,而敲低Smad2降低了融合蛋白的表达,提示Act A/Smads通路活性可影响融合蛋白表达水平。4.敲低Mfn2使M1型BV2比例增加,加剧BV2和共培养体系PC12的损伤,体现在细胞凋亡增加,活力减低,PC12铁死亡程度增加,表明Mfn2可调控小胶质细胞的极化表型,对自身以及共培养体系产生影响。5.gepia2、免疫荧光染色、双荧光素酶报告基因检测、q PCR等检测手段预测并验证了Smad2为Mfn2的转录因子,对其转录调控,表示Act A/Smads通路通过调节Mfn2的表达调控小胶质细胞的极化行为,进而对神经系统产生保护作用。结论:1.成功建立小胶质细胞OGD模型和小胶质细胞-神经元共培养模型,缺氧过程中Act A/Smads通路活性的改变调节BV2表型极化可对小胶质细胞及神经元状态产生影响。2.Act A/Smads通路活性通过调控小胶质细胞极化表型而对缺氧损伤中神经细胞起保护作用,表现在降低神经元ROS、MDA水平及增加GPX4、x CT和NRF2蛋白表达水平,其可能是通过减轻小胶质细胞介导的炎症神经损伤起保护作用。3.Act A/Smads可影响线粒体融合蛋白的表达水平,Act A/Smads在缺氧损伤中的保护作用可能通过调控Mfn2活性影响BV2的M2极化,进而对神经微环境产生保护作用。