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背景:香烟烟雾中含有多种公认的致癌物,与非吸烟人群相比,吸烟者罹患肺癌的风险显著增高。肺癌的发病率与吸烟密切相关。在我国大力倡导戒烟的背景下,吸烟或二手烟暴露诱发肺癌的发病率和死亡率仍居高不下,而既往对吸烟相关性肺癌的研究多为流行病学或临床研究,对于其相关的机制研究甚少,因此,本课题将在此方面进行初步的探索。SIRT6是组蛋白去乙酰化酶Ⅲ家族的成员之一,通过组蛋白H3去乙酰化,在细胞增殖、衰老、DNA修复以及肿瘤的发生发展等过程中发挥重要作用。研究表明,在不同肿瘤的组织样本中,SIRT6的表达不同。在肝癌、肾细胞癌、胃癌和结肠癌中,SIRT6呈低表达;而在骨肉瘤、前列腺癌、乳头状甲状腺癌中呈高表达;在乳腺癌中则发挥着双重作用。在大多数肺癌组织及细胞系相关研究中,SIRT6呈低表达,过表达SIRT6可以抑制肿瘤的增殖和侵袭。有报道显示,SIRT6与吸烟所致肺癌具有相关性,但具体调控机制尚不清楚。JAK2/STAT3信号通路是连接细胞内外的重要传导途径,参与肿瘤的发生发展。在我们前期的研究中,应用微流控技术,持续使用香烟提取物（cigarette smoke extract,CSE）诱导支气管上皮细胞,发现STAT3在CSE诱导的慢性炎症向恶性转化的过程中发挥了重要的作用。也有研究发现,在结肠癌、胃癌和胶质瘤细胞中,SIRT6可以通过抑制JAK2/STAT3途径抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡。然而,在吸烟相关性肺癌中SIRT6的表达及调控作用尚不清楚。本研究以人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞）为研究对象,探讨SIRT6在CSE暴露致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的调控作用,以及对JAK2/STAT3信号通路的调节作用,为进一步明确肺癌发生的分子机制提供新的思路,期待可以为吸烟相关性肺癌的治疗提供新的靶点。方法:1.CSE诱导BEAS-2B细胞恶性转化情况及SIRT6的表达水平（1）CCK8法筛选诱导BEAS-2B细胞恶性转化最适宜的CSE的作用浓度及作用时间;（2）RT-PCR法及Western blot法检测恶性转化细胞的致癌基因、SIRT6及相关蛋白表达水平;（3）建立CSE诱导的恶性转化细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.调控SIRT6对CSE诱导的BEAS-2B恶性转化细胞的作用及影响（1）将CSE成功诱导的BEAS-2B恶性转化细胞命名为“T3”细胞。慢病毒转染LV-SIRT6和LV-SIRT6-RNAi及相应的空载体LV-GV358和LV-GV248,建立稳定过表达及沉默的T3细胞株,将转染后的细胞分为五组:Ⅰ.T3-CON组（未转染组）;Ⅱ.T3-LV-GV358组（转染SIRT6过表达的空载体对照组）;Ⅲ.T3-LV-SIRT6组（转染SIRT6过表达组）;Ⅳ.T3-LV-GV248组（转染SIRT6沉默空载体对照组）;Ⅴ.T3-LV-SIRT6-RNAi组（转染SIRT6沉默组）;（2）CCK8法检测转染后各组细胞的增殖能力;（3）RT-PCR法及Western Blot法检测各组细胞的侵袭、细胞周期、凋亡相关基因m RNA和蛋白的表达情况;（4）Transwell法及划痕实验评价转染后各组细胞侵袭迁移能力;（5）流式细胞术检测转染后各组细胞周期情况;（6）流式细胞术及Mito-Tracker染色检测转染后各组细胞凋亡情况;（7）Western Blot法检测过表达及沉默SIRT6对T3细胞JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达情况。3.调控SIRT6对T3细胞裸鼠皮下移植瘤增长的影响（1）建立过表达及沉默SIRT6后的T3细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分组同上,观察各组裸鼠皮下成瘤情况,绘制肿瘤生长曲线;（2）RT-PCR法及Western Blot法检测各组肿瘤组织中转移、细胞周期、凋亡相关基因m RNA及蛋白的表达情况;（3）免疫组化检测各组肿瘤组织转移、细胞周期、凋亡相关蛋白的表达情况;（4）Western Blot法及免疫组化检测过表达及沉默SIRT6对T3细胞皮下移植瘤组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达情况。结果:1.给予作用浓度为50%的CSE持续诱导BEAS-2B细胞7天,恢复2周,命名为“T3细胞”。与对照组（无CSE暴露的BEAS-2B细胞）相比,T3细胞组相关致癌基因（K-ras,C-myc,Cyclin A1,Cyclin D1,CDK4和CDK6）m RNA和蛋白表达增加,而SIRT6的表达降低,且T3细胞具有裸鼠皮下移植瘤形成能力,揭示慢性暴露于CSE的BEAS-2B细胞发生恶性转化,具有致瘤性。2.调控SIRT6（过表达及沉默）能够明显影响T3细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移能力。当过表达SIRT6时,T3细胞中侵袭与迁移相关基因m RNA和蛋白的表达下调,抑制细胞侵袭和迁移能力;周期相关基因m RNA和蛋白的表达水平显著下调,细胞发生G1期阻滞;凋亡相关基因m RNA和蛋白的表达水平显著上调,促进细胞凋亡;与过表达SIRT6相比,沉默SIRT6对T3细胞的侵袭迁移、增殖、凋亡起到相反的调控作用。过表达SIRT6能够抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,沉默SIRT6后则促进信号通路的激活。3.过表达SIRT6能够抑制CSE诱导的T3细胞裸鼠皮下移植瘤的增长,移植瘤组织中转移及周期相关基因m RNA和蛋白的表达水平下调,凋亡相关基因m RNA和蛋白的表达水平上调,并且抑制JAK2/STAT3信号通路的激活;与过表达SIRT6相比,沉默SIRT6对移植瘤组织的细胞周期、凋亡、侵袭和转移及JAK2/STAT3信号通路的调控起相反的作用。结论:1.CSE能够诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化,具有裸鼠成瘤能力,可能与SIRT6的低表达有关。2.过表达SIRT6能够抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞的侵袭和迁移能力、发生细胞周期阻滞、诱导凋亡、抑制裸鼠的成瘤能力,可能成为诊治吸烟相关性肺癌的潜在靶点。3.在CSE诱导的BEAS-2B细胞中,SIRT6参与JAK2/STAT3信号通路的调控,可能为进一步明确吸烟相关性肺癌的分子机制提供理论依据。