论文部分内容阅读
番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)作为危害番茄生产的重要病毒。研究快速、高效的识别及检测该病毒的方法,有助于及时发现病毒并采取相应预防措施,从而减少其造成的经济损失。本研究通过RT-PCR对天津市、河北省番茄产区的番茄及周边寄主ToCV发生情况及ToCV与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)复合侵染情况进行检测鉴定,并建立了ToCV SYBR Green I实时荧光定量PCR快速检测方法,并对番茄不同品种、不同发病时期及不同发病部位的病毒含量进行了初步定量。主要结果如下:(1)对天津市、河北省的番茄产区采集的319份番茄样品和55份杂草样品进行ToCV检测。其中番茄样品ToCV检出率为16.0%,杂草上未检测到该病毒。获得的分离物序列(GenBank登录号KP219722/KP226698、KP217199/KP217201、KP217196/KP217197、KP217195/KP217202、KP217200/KP217198)与中国、日本和美国的分离物都聚类在同一个组上。(2)对感染ToCV的阳性样品进行TYLCV的检测,共检出27份样品受到ToCV和TYLCV复合侵染,复合率为53.0%。(3)根据GenBank上登录的ToCV HSP70的基因序列,设计了ToCV SYBR Green I实时荧光定量PCR的特异性引物,经验证得到了重组质粒。以所得质粒为模板对荧光定量PCR的退火温度和引物浓度进行了优化(退火温度为63°C,引物浓度为0.2μmol/L)。建立了标准曲线并得到了相应的回归方程:Ct=-3.227Log(copy number)+49.508。溶解曲线为特异性的单峰,且与瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato masaic virus,ToMV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)均无交叉反应,表明该方法特异性良好。与常规PCR相比灵敏度高100倍。组间和组内变异系数均小于5.0%,具有良好的重复性和稳定性。通过对不同部位、不同品种及接种不同时期番茄病毒含量检测发现,茎的韧皮部中含量最高,老叶次之,然后是根部,上部新叶病毒量最低;番茄品种中粉果T03抗病性最差;粉虱接种的番茄植株病毒含量在第28天后含量迅速增加。