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摘要 在广东番茄上发现一种新病害，病株表现为叶片褪绿，叶脉颜色变深及叶片增厚等症状。利用番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）HSP70基因的两对特异引物对番茄病样进行RTPCR检测，结果表明，从所采集的6份病样中均扩增到预期大小的DNA特异片段。对其中1份样品的扩增片段进行克隆与序列分析，结果表明，扩增片段包括1个长度为1 665个核苷酸的完整病毒基因，其核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70基因有较高的同源性，表明广东番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV广东番茄分离物的HSP70序列与国内外已报道的各分离物的同源性均低于82%，存在较大差异，其中与塞浦路斯tomato、约旦JU_20分离物的同源性最高，为81.8%。这是ToCV在广东发生的首次报道，也是该病毒HSP70基因序列存在显著差异分离物的首次发现。
关键词 番茄病毒病； 番茄褪绿病毒； HSP70基因
中图分类号： S 432.41
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.022
Abstract A new disease on tomato recently occurs in Guangdong Province. The symptoms of the diseased tomato plants include leaf chlorotic， vein darkgreening and leaf thickening. The expected DNA fragments were amplified from all 6 diseased samples with two specific primer pairs for HSP70 gene of Tomato chlorosis virus （ToCV） by RTPCR. And a full length of HSP70 （1 665 bp） was obtained by sequencing， which shared high nucleotides identity with those from other ToCV isolates. The result indicated that the collected tomato samples have been infected by ToCV in Guangdong. But there exists great difference in nucleotide sequence of HSP70 between the isolate from Guangdong （GD01） and other ToCV isolates from all over the world. The nucleotide sequence of HSP70 from isolate GD01 shared the highest identity （81.8%） with isolate tomato from Cyprus and JU_20 from Jordan. This paper was the first report on the occurrence of ToCV in Guangdong， and also the first report of significant difference in nucleotide sequence of HSP70 between ToCV GD01 and other isolates.
Key words tomato viral disease； Tomato chlorosis virus； HSP70 gene
番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus （ToCV）属于长线形病毒科 Closteroviridae 毛形病毒属 Crinvirus，其基因组为二分体正义单链RNA（ ssRNA），RNA1和RNA2分别包装在2种不同的病毒粒子中，RNA1含4个ORFs，编码与病毒复制相关蛋白等，RNA2含9个ORFs，编码外壳蛋白（CP）和热激蛋白（HSP70）等[12]。该病毒可由烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum Westwood、纹翅粉虱T.abutilonea Haldeman 、银叶粉虱B. argentifolii Bellows and Perring以半持久方式传播[12]，但不能经机械摩擦传播。该病毒可侵染茄科、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等科的多种植物[3]。番茄感染ToCV后，植株下部叶片黄化，叶脉浓绿而脉间褪绿，叶片变脆易折，严重时叶片黄褐色，甚至出现坏死等症状，番茄品质与产量严重下降[4]。
ToCV最早于1998年在美国佛罗里达州被发现[5]，随后在欧洲[68]、非洲[9]、亚洲[1015]、南美洲[16]、北美洲[1719]等多个国家和地区相继被报道。我国2004年首次在台湾番茄上发现该病毒[13]，尔后直到2012年一直未见该病毒的相关报道；但自2013年开始，该病毒陆续在江苏[20]、北京[14，21]、山东[4，2223]、河南[24]、河北[25]、天津[26]等蔬菜产区被发现。2015年初，我们在广东省惠州市番茄产区发现了疑似被ToCV侵染的番茄病株，且植株上烟粉虱数量较多。为了弄清该病害的病原种类，笔者对病样进行了分子检测与鉴定。
1 材料与方法
1.1 番茄病样
番茄病样叶片于2015年1月采自广东省惠州市番茄产区，共6份，编号为GD01～GD06。田间病株表现为下部叶片首先发病，叶片脉间变黄，叶脉颜色加深变成深绿色，叶片增厚，发病严重时植株死亡。 1.2 番茄叶组织总RNA提取
应用RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）抽提番茄病样叶片的总RNA。分别取6个番茄病样和1个健康番茄样品的叶组织100 mg，按照试剂盒说明书的步骤抽提总RNA，最终将RNA沉淀溶解于40 μL DEPC处理的ddH2O中。
1.3 RTPCR检测
分别以抽提的番茄叶片总RNA作为模板，用随机引物（TaKaRa公司）逆转录合成cDNA。反应体系和具体步骤为：模板RNA 4 μL，50 μmol/L random 6 mers引物 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNasefree dH2O 4 μL；65℃变性5 min后，冰上迅速冷却，然后再加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer（TaKaRa）4 μL、RNase Inhibitor （40 U/μL）0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase（200 U/μL）1 μL和RNasefree dH2O 4.5 μL，反应体系总体积为 20 μL，30℃孵育10 min后，42℃孵育50 min，最后70℃反应15 min使酶失活。
进一步利用ToCV HSP70 基因的2对特异引物HSP1F/R（HSP1F：GTTAACTCAGTTTAACTTGATTCCG；HSP1R：CACTTGACCAAATCGTCAAACG）和HSP2F/R（HSP2F：CATACAATATAATAAGTGATGATGGGAG；HSP2R：CAAGACAGTTAGTTCTCAGTACTAAAC）[12]分别进行PCR扩增。反应体系为：反转录产物 1 μL，灭菌水 9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa）10 μmol/L上下游引物各 1 μL，总体积为 25 μL。反应程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，35 个循环；72℃ 10 min。PCR产物经1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 PCR产物克隆和测序
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司） 回收病样GD01的PCR特异条带，纯化后克隆到 pMD20T 载体（TaKaRa）上，并转化大肠杆菌菌株 DH5α，随机挑取3个阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序。
1.5 序列分析
利用DNAStar软件（DNASTAR Inc，Madison，USA）对所获得的基因序列进行拼接，利用BLAST程序进行序列相似性搜索，进一步用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，进化树构建采用MEGA 5.05的邻接法（neighbor joining，NJ）。
2 结果与分析
2.1 病样RTPCR扩增结果
利用ToCV HSP70 基因的2对特异引物 HSP1F/R 和 HSP2F/R 分别进行RTPCR扩增，从6份番茄病样总RNA中均能扩增到1条与预期大小一致的特异片段，长度分别为943 bp和913 bp，而健康番茄样品中未扩增出任何片段（图1）。
2.2 HSP70 基因序列分析
PCR产物测序结果表明，引物HSP1F/R扩增获得的943 bp片段和引物HSP2F/R扩增获得的913 bp片段与设计预期相符；两片段3′端和5′端有70 bp序列相同，采用软件SeqMan对这两个片段序列进行拼接获得1 785 bp序列，其中包含有一个长度为1 665 bp的完整ORF。由此得出，广东番茄分离物GD01的HSP70全长为1 665个核苷酸（GenBank登录号：KT962275），编码554個氨基酸。BLAST结果显示，与该基因序列有较高同源性的序列均为ToCV分离物的HSP70基因，其氨基酸序列与ToCV各分离物的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。进一步比较（表1）显示，该基因序列与来自塞浦路斯、约旦、乌拉圭、古巴、土耳其、留尼旺岛、韩国、西班牙、美国、希腊、日本、巴西及中国等的22个ToCV分离物的序列同源性均在79%以上，其中与塞浦路斯tomato和约旦JU_20 分离物的同源性最高，为81.8%：与中国河北、山东、江苏、河南等分离物的同源性为80.2%～80.5%。这些结果表明，广东番茄受到了ToCV侵染，但所研究的GD01分离物HSP70基因与已报道分离物存在一定的差异。
为了分析分离物GD01与已报道各ToCV分离物的HSP70亲缘关系，选取了来自我国不同地区的7个分离物以及12个国家的15个ToCV分离物，以同属的番茄侵染性褪绿病毒Tomato infectious chlorosis virus西班牙TICVSP5131分离物（FJ542305）为外组构建系统进化树（图2）。可以看出，分离物GD01与来自中国不同地区的7个分离物及国外的15个ToCV分离物聚集在一个大的分支上，但独立在一个小分支上，说明广东番茄分离物GD01与已报道的ToCV各分离物亲缘关系相对较远。
3 讨论
本研究采用扩增长线形病毒科病毒最保守蛋白之一HSP70的2对特异引物 HSP1F/R 和 HSP2F/R 对广东省疑似ToCV侵染的番茄病样进行RTPCR检测，检测结果显示该批病样中确实存在ToCV，并获得了广东番茄分离物GD01的HSP70的全基因序列。序列分析显示，分离物GD01的HSP70氨基酸序列与GenBank登录的ToCV的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。根据目前国际病毒分类委员会第九次报告公布的分类方案[27]，确定侵染广东番茄的病毒分离物GD01属于ToCV的一个分离物，这是首次在广东省检测到该病毒。
ToCV广东番茄分离物GD01的HSP70基因序列与塞浦路斯ToCVtomato、约旦ToCVJU_20 分离物同源性最高，但仅为81.8%，而与中国其他地区分离物同源性最高为80.5%；中国已报道的ToCV各分离物的HSP70基因序列同源性均在99%以上，系统进化树分析显示ToCV所有分离物聚集在一个大的分支上，但分离物GD01独立在一个小分支上。由此可见，ToCV广东番茄分离物GD01与国内外已报道的分离物存在差异较大。推测造成这种差异的原因可能与病毒的地理分化有关，也有可能与传毒介体不同有关。无论是哪种原因占主导，本研究结果一方面说明危害我国的ToCV种群存在遗传多样性，另一方面揭示了我国粉虱传病毒的复杂性，这些都将为粉虱传病毒的重组、变异与流行提供条件，需要加强对其进行监测。 由ToCV侵染引起的番茄褪綠病毒病是我国近年暴发的一种新病害，目前已在河北、山东等黄河中下游番茄产区暴发和流行。例如，2013年山东省大面积暴发番茄褪绿病毒病，部分温室发病株率20%～100%，造成番茄减产10%～40%[22]。该病毒病也在江苏和台湾发生，但在华南地区还未见报道。ToCV可以侵染多种植物，我国目前已报道的寄主有番茄[4，2326]、甜椒[21]和茄子[2829]3种作物。这3种作物在广东省种植非常广泛，几乎遍及各个蔬菜产区；此外，传播介体粉虱在广东省常年普遍发生，一旦发生 ToCV，极有可能通过粉虱或种苗调运造成大面积暴发和流行。本研究首次在广东番茄产区发现了番茄褪绿病毒病，目前仅零星发生，应引起有关部门和生产者的重视。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
关键词 番茄病毒病； 番茄褪绿病毒； HSP70基因
中图分类号： S 432.41
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2017.02.022
Abstract A new disease on tomato recently occurs in Guangdong Province. The symptoms of the diseased tomato plants include leaf chlorotic， vein darkgreening and leaf thickening. The expected DNA fragments were amplified from all 6 diseased samples with two specific primer pairs for HSP70 gene of Tomato chlorosis virus （ToCV） by RTPCR. And a full length of HSP70 （1 665 bp） was obtained by sequencing， which shared high nucleotides identity with those from other ToCV isolates. The result indicated that the collected tomato samples have been infected by ToCV in Guangdong. But there exists great difference in nucleotide sequence of HSP70 between the isolate from Guangdong （GD01） and other ToCV isolates from all over the world. The nucleotide sequence of HSP70 from isolate GD01 shared the highest identity （81.8%） with isolate tomato from Cyprus and JU_20 from Jordan. This paper was the first report on the occurrence of ToCV in Guangdong， and also the first report of significant difference in nucleotide sequence of HSP70 between ToCV GD01 and other isolates.
Key words tomato viral disease； Tomato chlorosis virus； HSP70 gene
番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus （ToCV）属于长线形病毒科 Closteroviridae 毛形病毒属 Crinvirus，其基因组为二分体正义单链RNA（ ssRNA），RNA1和RNA2分别包装在2种不同的病毒粒子中，RNA1含4个ORFs，编码与病毒复制相关蛋白等，RNA2含9个ORFs，编码外壳蛋白（CP）和热激蛋白（HSP70）等[12]。该病毒可由烟粉虱Bemisia tabaci Gennadius、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum Westwood、纹翅粉虱T.abutilonea Haldeman 、银叶粉虱B. argentifolii Bellows and Perring以半持久方式传播[12]，但不能经机械摩擦传播。该病毒可侵染茄科、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等科的多种植物[3]。番茄感染ToCV后，植株下部叶片黄化，叶脉浓绿而脉间褪绿，叶片变脆易折，严重时叶片黄褐色，甚至出现坏死等症状，番茄品质与产量严重下降[4]。
ToCV最早于1998年在美国佛罗里达州被发现[5]，随后在欧洲[68]、非洲[9]、亚洲[1015]、南美洲[16]、北美洲[1719]等多个国家和地区相继被报道。我国2004年首次在台湾番茄上发现该病毒[13]，尔后直到2012年一直未见该病毒的相关报道；但自2013年开始，该病毒陆续在江苏[20]、北京[14，21]、山东[4，2223]、河南[24]、河北[25]、天津[26]等蔬菜产区被发现。2015年初，我们在广东省惠州市番茄产区发现了疑似被ToCV侵染的番茄病株，且植株上烟粉虱数量较多。为了弄清该病害的病原种类，笔者对病样进行了分子检测与鉴定。
1 材料与方法
1.1 番茄病样
番茄病样叶片于2015年1月采自广东省惠州市番茄产区，共6份，编号为GD01～GD06。田间病株表现为下部叶片首先发病，叶片脉间变黄，叶脉颜色加深变成深绿色，叶片增厚，发病严重时植株死亡。 1.2 番茄叶组织总RNA提取
应用RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）抽提番茄病样叶片的总RNA。分别取6个番茄病样和1个健康番茄样品的叶组织100 mg，按照试剂盒说明书的步骤抽提总RNA，最终将RNA沉淀溶解于40 μL DEPC处理的ddH2O中。
1.3 RTPCR检测
分别以抽提的番茄叶片总RNA作为模板，用随机引物（TaKaRa公司）逆转录合成cDNA。反应体系和具体步骤为：模板RNA 4 μL，50 μmol/L random 6 mers引物 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNasefree dH2O 4 μL；65℃变性5 min后，冰上迅速冷却，然后再加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer（TaKaRa）4 μL、RNase Inhibitor （40 U/μL）0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase（200 U/μL）1 μL和RNasefree dH2O 4.5 μL，反应体系总体积为 20 μL，30℃孵育10 min后，42℃孵育50 min，最后70℃反应15 min使酶失活。
进一步利用ToCV HSP70 基因的2对特异引物HSP1F/R（HSP1F：GTTAACTCAGTTTAACTTGATTCCG；HSP1R：CACTTGACCAAATCGTCAAACG）和HSP2F/R（HSP2F：CATACAATATAATAAGTGATGATGGGAG；HSP2R：CAAGACAGTTAGTTCTCAGTACTAAAC）[12]分别进行PCR扩增。反应体系为：反转录产物 1 μL，灭菌水 9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa）10 μmol/L上下游引物各 1 μL，总体积为 25 μL。反应程序：94℃ 4 min；94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，35 个循环；72℃ 10 min。PCR产物经1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 PCR产物克隆和测序
采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司） 回收病样GD01的PCR特异条带，纯化后克隆到 pMD20T 载体（TaKaRa）上，并转化大肠杆菌菌株 DH5α，随机挑取3个阳性克隆送上海生工生物技术有限公司测序。
1.5 序列分析
利用DNAStar软件（DNASTAR Inc，Madison，USA）对所获得的基因序列进行拼接，利用BLAST程序进行序列相似性搜索，进一步用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，进化树构建采用MEGA 5.05的邻接法（neighbor joining，NJ）。
2 结果与分析
2.1 病样RTPCR扩增结果
利用ToCV HSP70 基因的2对特异引物 HSP1F/R 和 HSP2F/R 分别进行RTPCR扩增，从6份番茄病样总RNA中均能扩增到1条与预期大小一致的特异片段，长度分别为943 bp和913 bp，而健康番茄样品中未扩增出任何片段（图1）。
2.2 HSP70 基因序列分析
PCR产物测序结果表明，引物HSP1F/R扩增获得的943 bp片段和引物HSP2F/R扩增获得的913 bp片段与设计预期相符；两片段3′端和5′端有70 bp序列相同，采用软件SeqMan对这两个片段序列进行拼接获得1 785 bp序列，其中包含有一个长度为1 665 bp的完整ORF。由此得出，广东番茄分离物GD01的HSP70全长为1 665个核苷酸（GenBank登录号：KT962275），编码554個氨基酸。BLAST结果显示，与该基因序列有较高同源性的序列均为ToCV分离物的HSP70基因，其氨基酸序列与ToCV各分离物的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。进一步比较（表1）显示，该基因序列与来自塞浦路斯、约旦、乌拉圭、古巴、土耳其、留尼旺岛、韩国、西班牙、美国、希腊、日本、巴西及中国等的22个ToCV分离物的序列同源性均在79%以上，其中与塞浦路斯tomato和约旦JU_20 分离物的同源性最高，为81.8%：与中国河北、山东、江苏、河南等分离物的同源性为80.2%～80.5%。这些结果表明，广东番茄受到了ToCV侵染，但所研究的GD01分离物HSP70基因与已报道分离物存在一定的差异。
为了分析分离物GD01与已报道各ToCV分离物的HSP70亲缘关系，选取了来自我国不同地区的7个分离物以及12个国家的15个ToCV分离物，以同属的番茄侵染性褪绿病毒Tomato infectious chlorosis virus西班牙TICVSP5131分离物（FJ542305）为外组构建系统进化树（图2）。可以看出，分离物GD01与来自中国不同地区的7个分离物及国外的15个ToCV分离物聚集在一个大的分支上，但独立在一个小分支上，说明广东番茄分离物GD01与已报道的ToCV各分离物亲缘关系相对较远。
3 讨论
本研究采用扩增长线形病毒科病毒最保守蛋白之一HSP70的2对特异引物 HSP1F/R 和 HSP2F/R 对广东省疑似ToCV侵染的番茄病样进行RTPCR检测，检测结果显示该批病样中确实存在ToCV，并获得了广东番茄分离物GD01的HSP70的全基因序列。序列分析显示，分离物GD01的HSP70氨基酸序列与GenBank登录的ToCV的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。根据目前国际病毒分类委员会第九次报告公布的分类方案[27]，确定侵染广东番茄的病毒分离物GD01属于ToCV的一个分离物，这是首次在广东省检测到该病毒。
ToCV广东番茄分离物GD01的HSP70基因序列与塞浦路斯ToCVtomato、约旦ToCVJU_20 分离物同源性最高，但仅为81.8%，而与中国其他地区分离物同源性最高为80.5%；中国已报道的ToCV各分离物的HSP70基因序列同源性均在99%以上，系统进化树分析显示ToCV所有分离物聚集在一个大的分支上，但分离物GD01独立在一个小分支上。由此可见，ToCV广东番茄分离物GD01与国内外已报道的分离物存在差异较大。推测造成这种差异的原因可能与病毒的地理分化有关，也有可能与传毒介体不同有关。无论是哪种原因占主导，本研究结果一方面说明危害我国的ToCV种群存在遗传多样性，另一方面揭示了我国粉虱传病毒的复杂性，这些都将为粉虱传病毒的重组、变异与流行提供条件，需要加强对其进行监测。 由ToCV侵染引起的番茄褪綠病毒病是我国近年暴发的一种新病害，目前已在河北、山东等黄河中下游番茄产区暴发和流行。例如，2013年山东省大面积暴发番茄褪绿病毒病，部分温室发病株率20%～100%，造成番茄减产10%～40%[22]。该病毒病也在江苏和台湾发生，但在华南地区还未见报道。ToCV可以侵染多种植物，我国目前已报道的寄主有番茄[4，2326]、甜椒[21]和茄子[2829]3种作物。这3种作物在广东省种植非常广泛，几乎遍及各个蔬菜产区；此外，传播介体粉虱在广东省常年普遍发生，一旦发生 ToCV，极有可能通过粉虱或种苗调运造成大面积暴发和流行。本研究首次在广东番茄产区发现了番茄褪绿病毒病，目前仅零星发生，应引起有关部门和生产者的重视。
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（责任编辑：杨明丽）