论文部分内容阅读
[研究背景及目的]研究背景:缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）对缺血心肌的保护是近年来缺血性心肌病防治的研究热点之一。近年来,有大量研究证实,IPC可以保护缺血心肌,IPC即通过短暂、可逆的心肌缺血发作,来增强心肌对后续的缺血性损伤的抵抗力。而一定强度的运动作为一种应激,也能使心肌细胞缺血缺氧,反复多次短暂一定强度的运动便可诱发心肌短暂多次的缺血,从而产生IPC,保护缺血心肌,这便是运动预适应（exercise preconditioning,EP）。有研究表明,EP可以通过多种不同的方式来激活体内多条信号通路,调控凋亡相关基因的表达,从而减轻心肌细胞凋亡,保护缺血心肌。我们课题组前期的研究发现,EP可增加抗凋亡基因Bcl-2表达、减少促凋亡基因Bax的表达,减少心肌细胞凋亡。另外,有研究发现,EP后心肌细胞内线粒体自噬的数目增多了,而凋亡的细胞数却显著减少,EP可能通过诱导线粒体自噬的方式来发挥心肌细胞的自我保护效应。EP减轻心肌细胞的凋亡的具体机制目前还未完全阐明清楚,EP可能会激发机体产生诸多信号,激活体内多条信号传导通路,如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）（PI3K-Akt）、AMPK-mTOR-UKL1 等,其中 PI3K-Akt 信号传导通路是细胞内最重要的信号传导通路之一,但目前为止,EP具体是通过什么信号通路来调控凋亡相关基因的表达、线粒体自噬与细胞凋亡之间的是否存在关联及其二者之间的具体关系是什么?目前还未完全阐明。目的:探究PI3K-Akt信号传导通路在运动预适应诱导线粒体自噬、减少心肌细胞凋亡中的作用。[方法]1、实验分组:选取40只健康SD大鼠,随机分为两组:A组为:运动预适应+急性心肌缺血组20只;B组为运动预适应+急性心肌缺血组20只+PI3K-Akt抑制剂（B组）;2、模型建立:A、B两组采用大鼠尾部负重3%体重负荷（于大鼠尾部缠绕金属丝线）进行间歇性游泳训练4周的方式建立运动预适应模型;在最后一次运动结束后,B组大鼠立即经大鼠尾静脉给药PI3K-Akt抑制剂LY294002（0.3 mg/kg）,A组同时注射等量生理盐水。30min后,A、B两组大鼠均采用腹腔注射异丙肾上腺素ISO（3mg/kg体重）的方式建立运动预适应后大鼠急性心肌缺血模型;3、心脏取材:完成上述步骤后,立即处死大鼠取心脏组织,分成若干份。一部分用于TUNEL法检测心肌细胞凋亡和免疫组化实验;一部分做成切片,电镜观察线粒体超微结构并对自噬体计数;剩下部分组织装于EP管中保存于-80℃冰箱中冷藏备检Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达;4、心肌细胞凋亡检测:应用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡情况,并计算凋亡指数（AI）,AI（%）=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%;5、线粒体自噬检测:应用光镜观察心肌细胞显微结构的变化;应用透射电镜观察心肌细胞超微结构的变化及自噬小体的形成,并统计自噬小体的数目;6、相关蛋白检测:采用 Western blot 测定 Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达情况;7、结果比较及分析:分别比较A、B两组大鼠心肌细胞凋亡指数（AI）、自噬小体数目及Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达并分析。[结果]1、两组大鼠存活率:试验后,A组大鼠存活18只（存活率:90%）,B组大鼠存活15只（存活率:75%）;2、两组大鼠Akt、P-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白表达水平:2.1两组大鼠PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平:与A组大鼠相比,B组大鼠Akt蛋白表达水平显著下降（608.8±43.37 vs 435.4±50.68）,（P<0.05）;与A组相比,B组P-Akt蛋白表达水平显著下降（378.6±75.21 vs 135.6±36.79）,（P<0.05）;这表明 LY294002 可以有效抑制 PI3K-Akt信号通路中Akt及磷酸化的Akt的表达。2.2两组大鼠心肌线粒体自噬相关蛋白表达水平:与A组相比,B组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著下降（309.5±44.78 vs 184.2±83.49）,（P<0.05）;与A组相比,B组Beciln-1蛋白表达水平显著下降（422.7±20.56vs 209.5±67.12）,（P<0.05）;3、两组大鼠心肌细胞显微结构的变化与自噬小体的形成3.1 光镜下两组大鼠心肌细胞显微结构的变化:用TUNEL染色后的心肌组织,在光镜下可以看见呈长条状分布的粉红色心肌纤维,以及蓝色的正常细胞和呈棕褐色或棕黄色凋亡细胞。A组切片可见排列规整的心肌纤维、其间间隙较小,可见大量蓝色正常细胞核和散在分布的少量棕色凋亡细胞核;B组大鼠心肌纤维肿大变形,排列紊乱,细胞间隙较大,可见大量棕褐色凋亡细胞和炎症细胞浸润。3.2电镜下两组大鼠心肌细胞线粒体超微结构的变化与自噬小体形成:A组大鼠可见肿胀的线粒体,大小不一,排列紊乱,偶可见少量空泡化的自噬小体;B组大鼠电镜下正常形态线粒体数目明显减少,可见大量变形水肿的线粒体,线粒体双层膜结构模糊或消失、线粒体嵴突有不同程度的变形、融合,可见大量空泡化的自噬小体;与A组大鼠相比,B组大鼠自噬小体数目明显减少（23 VS 15）,（P<0.05）。4、两组大鼠心肌细胞凋亡情况:与A组相比,B组可见广泛分布的细胞核呈棕褐色的凋亡细胞;与A组相比,B组大鼠心肌细胞凋亡指数更高（0.215 ± 0.004 vs 0.327±0.003）,（P<0.05）。[结论]1、PI3K-Akt信号传导通路可能是运动预适应减轻缺血心肌细胞凋亡的关键通路之一。2、运动预适应可以增加线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达,增加线粒体自噬,从而减少细胞调亡。