随着社会老龄化的进展、人们饮食结构与生活方式的改变,结肠癌的发病率不断增高。约60%患者在初诊时已处于病程的中晚期,失去了根治性手术治疗的机会。而早期患者根治术后一旦发生复发转移,也将会严重威胁患者的生存。深入探索结肠癌的发生转移机制,探索新型复发转移相关标志物已成为近年来的研究热点,对其深入探索将有助于优化结肠癌患者个体化精准治疗。本研究通过对既往基因芯片数据的深入挖掘,筛选出与结肠癌淋巴结转移相关的癌基因:双氧化酶2（Dual oxidase 2,DUOX2）,该基因位于人类15号染色体。该基因编码的蛋白质是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶家族的重要成员之一,主要参与甲状腺素的合成过程,该基因的突变或缺失可导致甲状腺激素生成障碍。近些年来,DUOX2在肿瘤的发生发展中的作用引起广泛关注。然而,DUOX2在结肠癌中的表达及功能尚不清楚。本研究中,对收集的结肠癌患者的组织标本进行q RT-PCR及IHC检测,结果显示:DUOX2 mRNA在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。DUOX2蛋白在结肠癌组织及转移淋巴结组织中的高表达与患者的不良预后相关。本研究通过敲低人结肠癌细胞中DUOX2的表达,进一步探索DUOX2对结肠癌恶性生物学行为的影响。结果显示:敲低DUOX2可显著抑制人结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞迁移及侵袭能力。为进一步探索DUOX2对结肠癌细胞迁移与侵袭能力影响的机制,我们对敲低DUOX2的结肠癌细胞进行NGS检测,敲低DUOX2后差异基因富集在Pathways in cancer、MAPK信号途径、PI3K-AKT信号途径、HTLV-1感染、Ras信号途径等通路中,该数据已上传至GEO数据库（标号:GSE139918）。此外,通过免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）及蛋白质谱分析（Mass spectrometry,MS）的方法,找到天然状态下DUOX2的候选互作蛋白:RPL3、TUBB4A、HADHB、BTN1A1。其中RPL3评分最高,且与DUOX2的亚细胞定位一致。免疫共沉淀（Co-Immunop-recipitation,co-IP）实验证实RPL3与DUOX2蛋白存在相互作用。随后我们在mRNA与蛋白水平对DUOX2与RPL3的相关性进行分析。敲低DUOX2基因后,RPL3的蛋白表达明显上调,而mRNA水平无明显变化,由此,DUOX2对RPL3可能存在转录后水平调节。由于RPL3蛋白半衰期很短,约为4小时,敲低DUOX2可使RPL3蛋白的降解速度减慢,进一步推测RPL3蛋白降解是通过泛素蛋白酶体途径介导的。在进一步的co-IP试验中,RPL3免疫复合物中检测到多泛素链,而敲低DUOX2后多泛素链的总数显著减少。由此,DUOX2通过影响RPL3的泛素化状态调控RPL3蛋白的表达水平。既往已有研究显示,RPL3的表达增加与肿瘤细胞的药物敏感性增强有关,RPL3表达降低可造成化疗药物失效。本研究发现RPL3蛋白与DUOX2蛋白存在相互作用关系,且RPL3蛋白水平受DUOX2调控,推测DUOX2蛋白极有可能也对结肠癌细胞药物敏感性产生影响。基于该假设,本研究设计实验,进一步探讨DUOX2在结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）药物敏感性中发挥的作用。结果显示:敲低结肠癌细胞DUOX2可以增强5-FU对细胞增殖的抑制作用,该结论在裸鼠模型中同样得到验证。本研究共分为以下四部分内容。第一部分DUOX2的筛选及其在结肠癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性目的:筛选与结肠癌淋巴结转移相关的癌基因,验证候选癌基因,检测DUOX2在结肠癌患者不同组织中的表达水平,并探讨DUOX2表达与临床病理参数及生存的相关性。方法:1.对本课题组既往基因芯片数据（GSE104836）进行再次深入分析,筛选与淋巴结转移相关的癌基因。收集24例结肠癌患者的癌组织与癌旁正常组织标本,利用q RT-PCR法对候选癌基因进行验证。2.扩大样本量至89例,收集结肠癌患者的新鲜癌组织标本和配对正常组织标本,利用q RT-PCR法检测癌组织与癌旁正常组织中DUOX2的表达水平,并收集所有患者的临床病理学参数。3.收集50例转移性结肠癌患者的切缘组织、结肠癌组织、转移淋巴结组织及转移肝组织蜡块标本,利用免疫组化法对上述不同组织中DUOX2蛋白表达进行检测,并对该50例患者进行生存随访。4.通过t检验、卡方检验进行统计学分析,明确DUOX2的表达水平与结肠癌患者临床病理参数的相关性。利用Kaplan-Meier法统计DUOX2蛋白表达与患者生存之间的相关性。结果:1.对既往芯片数据进行再次分析,筛选出9个与结肠癌淋巴结转移相关的癌基因:CCDC113、PODXL2、PDZK1IP1、SYNE4、SHH、MAGEA3、DUOX2、DUOXA2和NPFFR1。q RT-PCR结果显示:CCDC113、PODXL2、SYNE4、DUOX2、DUOXA2在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。PDZK1IP1、SHH、MAGEA3在结肠癌组织与癌旁正常组织中的表达无显著性差异,其中NPFFR1未能成功扩增,可能由于NPFFR1在结肠癌组织中的表达相对较低所致。DUOX2在结肠癌组织中的表达量最高,用于进行后续深入研究。2.qRT-PCR检测DUOX2在mRNA水平的相对表达。结果显示:与癌旁正常组织相比,结肠癌组织中DUOX2的mRNA表达水平明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）。淋巴结转移阳性（n=37）的结肠癌组织中DUOX2的表达明显高于淋巴结转移阴性（n=52）的结肠癌组织,差异有统计学意义（P<0.05）。3.分析DUOX2的mRNA表达与结肠癌患者的临床病理参数之间的相关性。结果显示:结肠癌组织中DUOX2的mRNA高表达与男性、T3+T4、N+、III+IV期有明显相关性（P<0.05）,而与其他临床病理学参数之间无显著相关性（P>0.05）。4.免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测DUOX2蛋白在不同组织中的表达。DUOX2蛋白在结肠癌组织、转移淋巴结组织与转移肝组织中的IHC评分均显著高于切缘组织（均P<0.001）,DUOX2蛋白在转移淋巴结组织与转移肝组织中的IHC评分均显著高于原发结肠癌组织（均P<0.001）。5.统计随访数据,结果显示:结肠癌组织中DUOX2蛋白为“+”、“++”、“+++”的患者生存时间分别为37.00个月、23.00个月和20.00个月,P<0.05;转移的淋巴结组织中DUOX2蛋白为“+/++”、“+++”的患者生存时间分别为28.75个月和21.50个月,P<0.05;转移的肝组织中DUOX2蛋白分别为“+/++”、“+++”的患者生存时间分别为23.70个月和26.00个月,P>0.05。小结:1.DUOX2在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织,并且在有淋巴结转移的结肠癌组织中的表达显著高于无淋巴结转移的结肠癌组织。2.DUOX2的mRNA表达水平与结肠癌患者的性别、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有明显相关性。3.DUOX2蛋白在结肠癌组织及转移的淋巴结组织中的高表达与患者的不良预后相关。第二部分DUOX2对结肠癌细胞生物学功能及5-FU敏感性的影响目的:研究敲低DUOX2表达对人结肠癌细胞株的增殖克隆、迁移侵袭能力的影响。探讨DUOX2对结肠癌细胞株5-FU药物敏感性的影响。方法:1.培养SW480、SW620、HCT116、HT29和DLD-1五种不同的结肠癌细胞株,同时培养人正常结肠上皮细胞株NCM-460。运用Western Blot方法检测上述细胞株中DUOX2蛋白质水平的表达情况。2.设计小干扰RNA（Small interferingRNA,siRNA）:si1-DUOX2、si2-DUOX2、si3-DUOX2及阴性对照si-NC,感染目标细胞,并通过Western Blot及q RT-PCR法检测DUOX2的敲低效率。3.用平板克隆形成实验和MTS实验检测细胞的克隆和增殖能力。4.应用划痕实验及Transwell实验来检测结肠癌细胞的迁移、侵袭能力。5.5-FU对结肠癌细胞增殖的抑制作用通过CCK-8法测定,分别计算不同分组的结肠癌细胞5-FU的IC50值。6.流式细胞技术检测不同分组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期分布情况。结果:1.用Western blot方法检测不同结肠癌细胞株中DUOX2的表达,结果显示:相较于NCM-460,DUOX2蛋白在SW480、SW620、HCT116、HT29和DLD-1细胞株中明显高表达。本研究中选择DUOX2表达水平中等的HCT116与SW480作为研究对象。2.HCT116和SW480细胞转染siRNA后,与阴性对照组（si-NC）细胞相比,si1-DUOX2与si2-DUOX2组DUOX2的mRNA及蛋白表达水平均明显降低,而si3-DUOX2组的DUOX2的mRNA及蛋白表达无显著变化。因而后续细胞功能试验选择si1-DUOX2与si2-DUOX2进一步研究。3.HCT116与SW480细胞敲低DUOX2表达后,检测0、24、48小时细胞的吸光度活力（OD值）,各组均无明显变化（P>0.05）。此外,克隆实验显示,与si-NC组相比,si1-DUOX2和si2-DUOX2组细胞的克隆能力无明显变化（P>0.05）。4.Transwel实验及划痕实验显示,与si-NC组细胞相比,si1-DUOX2和si2-DUOX2组细胞穿透膜的细胞数量明显减少（P<0.05）;划痕愈合能力明显受到抑制（P<0.05）,说明敲低DUOX2可显著抑制人结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞迁移及侵袭能力。5.CCK-8结果显示,利用不同浓度的5-FU处理不同分组的HT29和HCT116细胞后,敲低DUOX2的HT29与HCT116细胞（sh-DUOX2组）IC50均显著低于对照组（sh-Control组）[HT29:（31.43±3.92）vs.（48.42±6.23）μg/ml,P<0.01;HCT116:（15.5±4.42）vs.（29.3±7.56）μg/ml,P<0.01]。即:敲低DUOX2基因可以显著降低细胞5-FU药物的IC50值。6.流式细胞学结果显示:sh-DUOX2+5-FU组的HT29和HCT116细胞的凋亡率均明显高于sh-Control+5-FU组和sh-Control组。细胞周期检测显示:相较于sh-Control组,5-FU对sh-DUOX2组细胞的G0/G1期阻滞能力增强。小结:1.转染si1-DUOX2与si2-DUOX2可显著抑制HCT116和SW480细胞株DUOX2的表达水平。2.敲低DUOX2对HCT116和SW480细胞株的增殖能力无显著影响。3.敲低DUOX2表达后,HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力显著下降。4.敲低结肠癌细胞中DUOX2的表达可显著增强5-FU对结肠癌细胞的致凋亡作用,亦可增强5-FU对结肠癌细胞周期的阻滞作用。第三部分DUOX2对结肠癌细胞生物学功能影响的机制研究目的:探索人结肠癌细胞DUOX2的互作蛋白及关键信号通路,进一步揭示DUOX2影响结肠癌细胞生物学功能的机制。方法:1.收集SW480细胞的蛋白裂解液,利用免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）与质谱分析（Mass spectrometry analysis,MS）技术找到DUOX2的互作蛋白,利用免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation,co-IP）方法对候选互作蛋白RPL3进行验证。2.在HCT116和SW480细胞中,敲低DUOX2表达后应用q RT-PCR及Western Blot法检测RPL3在mRNA水平及蛋白水平表达变化。并在结肠癌患者的肠癌标本中应用q RT-PCR和IHC法进一步验证。3.向sh-Control组与sh-DUOX2组细胞中加入放线菌酮（CHX）,用来抑制细胞中蛋白合成。并收集不同时间点（0h、2h、4h、6h、8h、10h）的细胞蛋白,利用Western Blot法观察RPL3蛋白稳定性的变化情况。敲低DUOX2后,加入蛋白酶体抑制剂MG132处理,观察RPL3蛋白降解的变化情况。分别收集HCT116和SW480细胞的sh-Control与sh-DUOX2组蛋白裂解液,利用RPL3抗体进IP试验,应用Western Blot法检测不同分组中泛素蛋白的变化情况。4.构建DUOX2过表达质粒（pc DNA3.1-DUOX2）、RPL3过表达质粒（pc DNA3.1-PRL3）及空载对照组（pc DNA3.1-Control）,在HCT116和SW480细胞中分别转染pc DNA3.1-Control、pc DNA3.1-DUOX2及pc DNA3.1-PRL3,Western Blot法验证质粒的过表达效率。通过Transwell及划痕试验检测RPL3过表达对于DUOX2过表达造成的细胞迁移侵袭能力增强的影响。5.利用NGS技术,对DUOX2低表达的HCT116细胞（si1-DUOX2、si2-DUOX2）及对照组细胞（si-NC）进行全mRNA检测,找到差异基因富集的通路,并在基因及蛋白水平进行验证。结果:1.IP及MS分析结果显示:RPL3、TUBB4A、HADHB、BTN1A1为DUOX2的候选下游基因。co-IP结果显示:RPL3与DUOX2蛋白存在相互作用。2.在HCT116和SW480细胞中,敲低DUOX2表达后,RPL3的mRNA水平未见明显变化,而蛋白表达明显上调。取转移性结肠癌患者的不同部位组织标本进行验证,结果显示:DUOX2与RPL3在结肠癌组织、转移淋巴结组织及转移的肝组织标本中蛋白水平存在显著负相关的关系（Kendal’s tau＿b分别为-0.354、-0.323及-0.285）,而在mRNA水平无显著相关性。3.敲低DUOX2后,CHX处理10小时,RPL3蛋白稳定性显著升高;加入蛋白酶体抑制剂MG132后,相较于sh-Control组,sh-DUOX2组进入泛素化降解途径的RPL3更少。4.转染质粒后,与pc DNA3.1-Control相比,pc DNA3.1-DUOX2组的DUOX2蛋白表达明显升高;pc DNA3.1-PRL3组的RPL3蛋白水平明显升高。过表达DUOX2的细胞迁移、侵袭能力明显提高,而同时过表达RPL3则可逆转由于DUOX2过表达造成的高迁移、侵袭能力。5.NGS结果显示（原始数据已上传至GEO数据库,编号:GSE139-918）:si1-DUOX2对比si-NC差异基因主要富集在Pathways in cancer、MAPK、PI3K-AKT、HTLV-1感染等信号通路中;si2-DUOX2对比si-NC差异基因主要富集在Pathways in cancer、PI3K-AKT、RAS、MAPK等信号通路中。其中PI3K-AKT信号通路中EGFR、AKT1与MYC变化最明显。敲低DUOX2后,EGFR基因的表达水平显著降低,而AKT1和MYC基因的表达水平显著升高。过表达DUOX2后,EGFR蛋白水平升高,AKT、p-AKT和c-MYC蛋白水平显著降低。RPL3蛋白水平的升高不能逆转EGFR的升高,但能逆转AKT、p-AKT和c-MYC的降低。小结:1.RPL3与DUOX2在蛋白水平存在显著的负相关关系,而在mRNA水平无显著相关性。2.DUOX2通过影响RPL3的泛素化降解过程影响RPL3蛋白表达。3.RPL3可逆转DUOX2对细胞迁移侵袭能力的影响。4.敲低DUOX2后,差异基因大量富集在PI3K-AKT信号通路中,通路中部分因子表达变化可被RPL3逆转。第四部分敲低DUOX2对结肠癌细胞裸鼠成瘤及裸鼠移植瘤5-FU敏感性的影响目的:通过构建裸鼠皮下移植瘤及内脏转移模型,探索敲低DUOX2基因对裸鼠皮下成瘤及肝肺转移瘤形成的影响,并探讨DUOX2对皮下移植瘤的5-FU疗效的影响。方法:1.应用慢病毒感染技术构建稳定低表达DUOX2的HCT116和HT29细胞株（sh-DUOX2）及相对应的阴性对照（sh-Control）。Western Blot法检测慢病毒敲低效率。2.将5周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为6组。取HCT116的sh-DUOX2组与sh-Control组等量细胞分别注射至裸鼠皮下（n=6只/组,1×106个细胞/只）;另取HCT116的sh-DUOX2组与sh-Control组等量细胞经尾静脉注入（n=5只/组,1×106个细胞/只）;另取HT29细胞的sh-DUOX2组与sh-Control组等量细胞尾静脉注射至裸鼠体内（n=6只/组,1×106个细胞/只）。3.取裸鼠的转移瘤组织、肺组织及肝组织标本进行HE染色,统计不同分组裸鼠肝脏与肺脏转移瘤的发生情况。4.另取20只BALB/c裸鼠,随机分成2组（10只/组）,将HT29细胞（分为2组:sh-Control组与sh-DUOX2组）注射到裸鼠腋窝中后部皮下（1×106个细胞/只）。当出现肉眼可见的皮下结节后,随机在两组裸鼠中各取5只,腹腔注射5-FU（5mg/kg）药物,给药频率为:1次/3天,每周对裸鼠移植瘤的长短径进行测量与记录。在本研究中,肿瘤体积=1/2×长径×短径2。4周后处死裸鼠,剥除移植瘤并称其质量。结果:1.转染慢病毒后,HCT116和HT29细胞中DUOX2的mRNA及蛋白表达水平明显降低。2.皮下移植瘤模型显示:与sh-Control组相比,sh-DUOX2组肿瘤重量无明显变化。对两组皮下移植瘤进行免疫组化染色,结果显示:DUOX2蛋白与RPL3蛋白之间存在负相关关系。3.尾静脉注射模型显示:接受HT29细胞尾静脉注射的裸鼠,sh-DUOX2组的肺转移及肝转移发生率明显降低。此外,sh-Control组与sh-DUOX2组均出现颈部转移结节,sh-DUOX2组结节重量明显低于sh-Control组。4.未经腹腔注射5-FU治疗的sh-Control组与sh-DUOX2组裸鼠的移植瘤体积及质量之间无显著差异;与未治疗的sh-DUOX2组相比,腹腔注射5-FU治疗的sh-DUOX2+5-FU组裸鼠移植瘤的体积及质量均显著降低;sh-DUOX2+5-FU组裸鼠移植瘤体积与质量明显低于sh-Control+5-FU组。即:敲低DUOX2可显著提高5-FU的治疗效果。小结:1.敲低DUOX2的表达对裸鼠皮下移植瘤增殖无显著影响。2.敲低DUOX2的表达可显著降低裸鼠肺转移与肝转移的发生率。3.敲低DUOX2的表达可显著提高皮下移植瘤对5-FU药物治疗的敏感性。结论:1.与癌旁正常组织相比,结肠癌组织中DUOX2的mRNA表达水平显著上调,且与患者性别、浸润程度、淋巴结转移、TNM分期存在显著相关性;DUOX2蛋白在结肠癌组织及转移淋巴结组织中的高表达与患者的不良预后相关;2.体外敲低DUOX2表达对结肠癌细胞HCT116和SW480的增殖能力无显著影响,但可明显抑制细胞的迁移、侵袭能力;3.作为DUOX2蛋白的下游互作蛋白,RPL3与DUOX2蛋白为负相关关系,DUOX2通过影响RPL3的泛素化降解过程影响RPL3蛋白表达。RPL3可逆转DUOX2对细胞迁移侵袭能力的影响;4.敲低DUOX2后,差异基因大量富集在PI3K-AKT信号通路中,通路中部分因子表达变化可被RPL3逆转;5.敲低DUOX2表达可显著减少裸鼠的肺转移与肝转移发生率。而对裸鼠皮下移植瘤增殖无显著影响;6.敲低结肠癌细胞中DUOX2的表达可显著增强细胞对5-FU的药物敏感性。